Aula Validação

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"Valida o de metodologia na rea qu mica"

Procedimento pr tico de valida o de m todos anal ticos f sicoqu micos

Shirley Abrantes

14 a 16 de outubro de 2003

V Encontro do Instituto Adolfo LutzCentro de Conven es Rebou asS o Paulo/SP e. mail: shirley@incqs.fiocruz.br

Conte do

1 Planejamento de valida o 2 Como proceder para determinar as caracter sticas de desempenho de m todos 2.1 Aplicabilidade 2.2 Faixa de trabalho 2.3 Linearidade 2.4 Faixa linear de trabalho 2.5 Sensibilidade 2.6 Homocedasticidade/heterocedasticidade 2.7 Limite de detec o 2.8 Limite de determina o/quantifica o 2.9 Exatid o/recupera o 2.10 Precis o 2.10.1 Repetitividade 2.10.2 Precis o intermedi ria 2.10.3 Reprodutibilidade 2.11 Seletividade 2.12 Robustez

Valida o

Um processo atrav s do qual estudos de laborat rio s o utilizados para garantir que o m todo em quest o atenda s exig ncias desejadas

FDA. International Conference on Validation of Analytical Procedures: Definitions and Terminology; Availability. Federal Register. V. 60 (40) p. 1126011262, March, 1995.

Tipo de m todo

Teste de Quantitativo Sim

Procedimento anal tico Exatid o Precis o Repetitividade Precis o Intermedi ria Especificidade LD LQ Linearidade Faixa

Identifica o N o

Impureza Ensaiolimite N o

Doseamento Sim

N o N o Sim N o N o N o N o

Sim Sim Sim N o Sim Sim Sim

N o N o Sim Sim N o N o N o

Sim Sim Sim N o N o Sim Sim

Par metros de desempenho anal tico a serem avaliados

s s s s s s s s s s s s

Aplicabilidade Faixa de trabalho Linearidade Homocedasticidade/heterocedasticidade Faixa linear de trabalho Sensibilidade Limite de detec o Limite de determina o/quantifica o Precis o (repetitividade, precis o intermedi ria e reprodutibilidade) Exatid o/Taxa de recupera o Seletividade Robustez

Aplicabilidade

Determinar qual ou quais matrizes e analito ou analitos para que o m todo anal tico serviria, Identidade do analito, incluindo especifica o onde apropriado (p. ex: ars nio total), Faixa de concentra o coberta pela valida o (p. ex: 0 50 mg/kg), Uma especifica o da faixa de matrizes do material teste coberta pela valida o (p. ex: frutos do mar), Descrever o equipamento, reagentes, procedimento (incluir varia o permiss vel p. ex: aquecer 100 5 C por 30 5min), procedimento de calibra o e qualidade e, precau o de seguran a especial necess ria, A aplica o pretendida e sua incerteza cr tica (p. ex: an lise de alimento para monitoramento). A incerteza padr o u(c) do resultado c deveria ser 0,1 x c.

THOMPSON, M., ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p. 835855, 2002.

Faixa de trabalho

A faixa de trabalho (FT) pode ser definida entre um d cimo a dobro do limite de restri o (LR)

FRAUNHOFER INSTITUT F R LEBENSMITTELTECHNOLOGIE UND VERPACKUNG Guide for testing of analytical method for the determination of monomers in foods simulants and polymers. M nchen. 3p. M&T Project "Development of methods of analysis". Printed papers.

0,1 . LR FT 2 . LR

Linearidade

a habilidade das respostas anal ticas serem diretamente proporcionais s concentra es das subst ncias em estudo. Ser verificada analisando em triplicata solu es padr o com 6 ou mais concentra es diferentes, dispostas em um intervalo estabelecido pela faixa de trabalho. Os valores encontrados para confec o da curva anal tica t m que estar livres de valores aberrantes e os mesmos devem apresentar homocedasticidade.

C lculo do ponto duvidoso na curva anal tica

Podese verificar se algum ponto de concentra o desvia da linearidade da curva por meio do c lculo dos res duos entre os valores medidos e os valores calculados a partir da equa o da curva. Calcular um ponto duvidoso de uma curva anal tica pelo valor de t. tcalculado= res duo sr/n

Onde:

res duo = xmedido xcalculado sr =desvio padr o dos res duos n = n mero de pontos da curva

2 sr = (x x ) medido calculado n 1

Procedimento para determina o da linearidade

Como o limite de restri o estabelecido pela Resolu o 105 de 19051999 da ANVISA/MS de 0,25% m/m de estireno na massa pl stica, a faixa de trabalho de 0,025 a 0,50% m/m

0,025 FT 0,50% m/m

Procedimento para determina o da linearidade

Considerando a massa tomada da amostra de 300mg, a faixa de concentra o na al quota analisada seria de 7,5 a 150mg/L. Por praticidade, fezse a faixa de 10 a 150mg/L

Preparo da solu o m e Pesouse 0,1066g de estireno com 99% de pureza. Diluiuse esta massa em bal o volum trico de 100mL com nheptano. Considerando a pureza do estireno 99%, o procedimento resultou em solu o com concentra o de 1,055mg/mL

Preparo da solu es de trabalho Solu es de trabalho Com pipetas volum tricas, tomouse al quotas da solu o m e para preparo das solu es de trabalho. Todas as al quotas foram avolumadas a 100mL com nheptano

Volumes tomados da solu o m e e concentra o das solu es de trabalho

Volume Tomado (mL) Concentra o (mg/L)

1 2

5 10

0,00 10,55 21,10 52,75 105,5

Preparo da curva anal tica

Os pontos de concentra o das solu es de trabalho foram analisados no cromat grafo. As reas dos picos correspondentes ao tempo de reten o do estireno em rela o aos pontos de concentra o foram medidos e, uma curva anal tica foi constru da a partir das reas com seus correspondentes pontos de concentra o das solu es de trabalho

Determina o da estabilidade da solu o m e De semana em semana retiramos uma al quota de 5mL da solu o m e de estireno em heptano e avolumamos com heptano para 100mL em bal o volum trico. Tomamos uma al quota desta solu o e injetamos em cromat grafo a g s. Observamos se o resultado da concentra o obtida semelhante ao obtido inicialmente na confec o da curva anal tica

Homocedasticidade/heterocedasticidade

a independ ncia ou depend ncia da vari ncia das respostas com as concentra es do analito

Determina o da homocedasticidade Analisouse em triplicata todos os pontos da curva anal tica (10,55 105,5 mg/L), calculando em seguida as vari ncias das respostas de cada ponto de concentra o. Dividiuse a maior vari ncia (S2) pelo somat rio das vari ncias ( S2). O valor obtido comparado com o valor tabelado

Vari ncia S2 = 1/n1 [xi X(m dio)]2

Homocedasticidade

Se o valor calculado for menor que o tabelado de Cochran, o m todo homoced stico. Portanto, a curva anal tica pode ser constru da pelo m todo dos m nimos quadrados normais

C cal = S2 maior/ S2

Determina o da faixa de trabalho

Faixa de trabalho a faixa de concentra o do analito na amostra que apresenta resposta linear com a concentra o

A faixa de trabalho(conc. na al quota de an lise 10,55105,5 mg/L) possibilitou detectar o estireno dentro dos limites de interesse e a resposta do detector do cromat grafo conservouse linear, que foi de 0,035 a 0,35 % m/m concentra o na amostra

Sensibilidade

Descreve quanto a resposta varia com a varia o da concentra o do analito. Pode ser expressa como a inclina o da curva anal tica (coeficiente angular), expresso pala equa o S=dx/dc, onde: dx=varia o da resposta, dc=varia o da concentra o medida ao mesmo tempo que testa a linearidade Depende da natureza do analito e da t cnica de detec o

BRUCE, P. , MINKKINEN, P. , RIEKKOLA, M. L. Practical Method Validation: Validation sufficient for an Analysis Method. Mikrochimica ACTA. V. 128, p. 93106, 1998.

Limite de detec o LD a mais baixa concentra o da subst ncia em exame que pode ser detectada com um certo limite de confiabilidade utilizando um determinado procedimento experimental

Determina o do limite de detec o

O limite de detec o foi determinado analisando 6 vezes a menor concentra o da curva anal tica, e o desvio padr o foi multiplicado por 3, este limite referente a al quota de an lise. Tem que se considerar o procedimento do m todo para se determinar o limite de detec o do m todo. Desvio padr o: igual a raiz quadrada positiva da vari ncia e tem a mesma dimensao da m dia aritm tica

S = 1/(n1)[xi X(m dio)]2

THOMPSON, M., ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p. 835855, 2002.

Limite de determina o/quantifica o LQ

a mais baixa concentra o da subst ncia em exame que pode ser quantificada com certo limite de confiabilidade utilizando um determinado procedimento experimental

Limite de quantifica o LQ

Geralmente o mais baixo ponto da curva anal tica n o deve ser determinado por extrapola o

UKAS PUBLICATION ref: LAB 27, United Kingdom Accreditation Service. www.ukas.com

Precis o

Repetitividade

Precis o intermedi ria Reprodutibilidade

Repetitividade

o grau de concord ncia entre resultados de an lises individuais quando o procedimento aplicado repetidamente m ltiplas an lises de uma mesma amostra homog nea, em id nticas condi es de teste.

Determina o da repetividade

Um m nimo de 9 determina es cobrindo a faixa espec fica para o procedimento (p. ex: 3 concentra es/3 replicatas cada, menor, intermedi ria e maior); ou

Um m nimo de 6 determina es a 100 % de concentra o teste

Calcular o desvio padr o, o desvio padr o relativo ou coeficiente de varia o ou a vari ncia.

GUIDANCE FOR INDUSTRY Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodology U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics evaluation and Research, November 1996 ICH.

Precis o intermedi ria

Expressa as varia es dentro de um laborat rio, como: dias diferentes, analistas diferentes, m todos diferentes, ou equipamentos diferentes, sobre uma mesma amostra ou padr o, definindo exatamente quais as condi es a variar (uma ou mais)

Determina o da precis o intermedi ria

Os resultados dos dados obtidos em dias alternados, por um mesmo analista, usando um mesmo equipamento, mesmas concentra es e mesma metodologia, dever o ser o mesmo: pode ser comprovado por teste t, onde a hip tese a ser afirmada que o resultado obtido em diferentes dias s o significativamente iguais.

Hip tese a ser testada: Ho: 1= 2 Teste t T=( xmed)/s.(n)1 onde: =valor de refer ncia, xmed=m dia dos valores dos resultados de an lise, n=n mero de resultados de an lise e s=desvio padr o O valor cr tico (tabelado) varia em fun o do grau de liberdade () e do n vel de confian a, sendo que. = n 1 Se: ttab tcalcHo aceita ttab tcalcHo rejeitada

Reprodutibilidade

o grau de concord ncia entre os resultados das medi es de um mesmo mesurando, efetuadas sob condi es variadas de medi o(VIM). A reprodutibilidade n o um componente de valida o de m todo executado por um nico laborat rio, obtido em rela o aos dados de valida o obtidos atrav s de compara o interlaboratorial (INMETRO, 2002).

INMETRO. Orienta es sobre valida o de m todos de ensaio qu micos. DOQCGCRE008, revis o:00outubro 2002.

VIM Vocabul rio Internacional de termos Fundamentais e Gerais de Metrologia, 1995.

Exatid o

a concord ncia dos valores experimentais com o valor verdadeiro X

Taxa de Recupera o

a rela o entre o resultado experimental obtido depois da an lise de uma amostra, fortificada com uma quantidade conhecida do analito, e o valor te rico desta quantidade fortificada

Determina o da taxa de recupera o

A taxa de recupera o ser calculada pela divis o entre o resultado da concentra o m dia experimental e a concentra o te rica multiplicada por 100.

Taxa recupera o=[conc. Exp./conc. Teor] x 100.

Seletividade

a interfer ncia por outra subst ncia, que n o seja o analito de interesse, na medi o pelo detector

Determina o da seletividade

Analisase tr s vezes a solu o de estireno em heptano na concentra o de (10,55mg/L) e depois analisase tr s vezes uma amostra que apresente na al quota de an lise uma concentra o pr xima a concentra o de (10,55mg/L) e depois calculase o teste de igualdade de duas m dias de amostras independentes (t)

Determina o da seletividade

O c lculo do valor de t quando se comparam m dias de duas amostras diferentes dado pela express o t =

- x 2 x1

Sa 1 / n1 + 1 / n2

Determina o da seletividade

Sa a estimativa do desvio padr o agregado, calculado a partir das estimativas dos desvios padr es das duas amostras

(n1 - 1) S + (n2 - 1) S n1 + n 2 - 2

2 1

2 2

Robustez

a capacidade de um m todo de n o ser afetado por uma pequena e deliberada modifica o em seus par metros

Determina o da robustez