Contagem de microorganismos através das técnicas spread-plate e pour-plate

Contagem de microorganismos através das técnicas spread-plate e pour-plate

Introdução

Práticas laboratoriais são utilizadas comumente para contagem de microrganismos presentes em uma determinada amostra. Dentre essas práticas, destacamos as técnicas de espalhamento em superfície (spread-plate) e plaqueamento em profundidade (pour-plate). A primeira técnica consiste em sucessivas diluições da amostra, e que em cada diluição é espalhada em duas placas de Petri contendo meio de cultura 0,1 ml da amostra. Também conhecido como método das diluições seriadas, este método serve tanto para o isolamento quanto para contagem de microorganismos. Após o plaqueamento e incubação, por tempo e temperatura adequados, as células ou pequenos agrupamentos vão crescer isoladamente, dando origem a colônias que serão contadas na diluição apropriada e, portanto, chamadas de unidades formadoras de colônia (UFC). Evidentemente, nos tubos muito diluídos não teremos células suficientes, ao mesmo tempo em que nos tubos muito concentrados teremos excesso de células, e assim sendo não será possível se fazer uma contagem adequada nas respectivas placas. O ideal é que cada placa escolhida para contagem contenha um número considerado significativo no método em questão, o que para bactérias em geral seria de 30 a 300 colônias. Para que os resultados obtidos sejam estatisticamente válidos, faz-se a duplicata de placas para cada diluição. Após os cálculos adequados, levando-se em conta diluição e volume, é possível determinar a quantidade de microorganismos presentes em determinado peso ou volume do material inicial. Já a segunda técnica tem como meio de cultura o ágar fundido que permite o crescimento não só ao longo da superfície como no interior do ágar. É adicionado 1,0 ml da amostra no fundo de uma placa estéril e em seguida adicionado o ágar, ainda líquido, mantido a cerca de 40-45°C. A homogeneização do inoculo é feita com movimentos suaves em forma de “8” sobre a bancada. É preciso garantir que o meio não solidifique antes da homogeneização nem fique muito quente para não matar as células microbianas.

Objetivos

Determinar o número de microrganismos presentes na suspensão através dos métodos de contagem em placa.

Materiais Utilizados

- Placas de Petri com meios de cultura;

- Tubos de diluição;

- Bico de Busen;

- Pipetas;

- Alça de Drigalski;

- Meios de cultivo fundidos.

Procedimentos

Spread-plate

Foram cedidas pelo laboratório, duas amostras de efluentes de entrada e saída de uma Estação de Tratamento de Esgoto, respectivamente. Foi utilizada a amostra da água de saída da estação. Pipetamos 1 ml em duas placas com meio de cultura e espalhamos pela superfície com o auxílio da alça de Drigalski. Em seguida, foram feitas diluições desse efluente (1 ml da amostra em 9 ml de líquido de diluição, depois 1 ml da amostra diluída em outro tubo contendo 9 ml de líquido de diluição).

Obs.: Sabendo-se que 9 ml dissolvem 10 vezes a quantidade de 1 ml, dizemos que a primeira diluição é de 10-1, a segunda diluição 10-2 e assim sucessivamente.

Com a pipeta, pegamos 1 ml da amostra, foi espalhada pela superfície com a alça de Drigalski em uma placa contendo meio de cultura sólido. Foram feitas duplicatas de placas da diluição 10-1 a 10-3.

Obs.: Descarta-se a pipeta após cada diluição. Também após cada diluição, é levado o tubo ao agitador por 10 segundos para homogeneizar a amostra.

As placas foram incubadas e visualizadas após 48 horas.

Pour-plate

Já para o método pour-plate foi cedida pelo laboratório amostra da água da saída da lagoa de estabilização da Morada do Ouro. Foi utilizado o mesmo método de diluição do spread-plate, e as diluições utilizadas foram 10-1,10-2 e 10-3.

Foi inoculado 1 ml da diluição 10-1 no fundo de cada uma das duas placas estéreis (duplicata). Foi feito esse mesmo processo na diluição 10-2 e na diluição 10-3. Em seguida foi derramado 18 ml do meio de cultura fundido por cima. Foram feitos movimentos suaves com as placas em forma de “8” em cima da bancada, tomando-se cuidado para não derramar.

As placas foram incubadas e visualizadas após 48 horas.

Resultados

Spread-plate

Após 48 horas de incubação, foi feita a contagem de colônias em cada placa. Nas placas da diluição 10-1 foram contadas 174 colônias em uma e 166 colônias em outra. Nas placas da diluição 10-2 foram encontradas 40 colônias em uma e 42 colônias em outra. Nas placas da diluição 10-3 foram encontradas 7 colônias em uma e 9 colônias em outra.

Para se confirmar o número de microorganismos em uma amostra, foi feito um cálculo com base no número de colônias encontradas:

(Número de colônias x 10) ÷ diluição = UFC em 1 ml

Com base nesse cálculo, foram encontradas em UFC (unidades formadoras d colônia) por ml:

  • Na diluição 10-1 → 17000 UFC/ml

  • Na diluição 10-2 → 41000 UFC/ml

  • Na diluição 10-3 → 80000 UFC/ml

Pour-plate

Após 48 horas de incubação, foi feita a contagem de colônias em cada placa. Nas placas da diluição 10-1 não foi possível realizar a contagem, por conter excesso de colônias. Nas placas da diluição 10-2 foram encontradas 158 colônias em uma e 234 colônias em outra. Nas placas da diluição 10-3 foram encontradas 24 colônias em uma e 22 colônias em outra.

Para se confirmar o número de microorganismos em uma amostra, foi feito um cálculo com base no número de colônias encontradas:

Número de colônias ÷ diluição = UFC em 1 ml

Com base nesse cálculo, foram encontradas em UFC (unidades formadoras de colônia) por ml:

  • Na diluição 10-2 → 19600 UFC/ml

  • Na diluição 10-3 → 23000 UFC/ml

Discussão

As técnicas spread-plate e pour-plate são importantes para a Engenharia sanitária e Ambiental, pois permite quantificar bactérias em águas e efluentes. É importante ressaltar que os efluentes lançados pelas indústrias têm grande potencial poluidor e águas não tratadas adequadamente podem possuir patógenos. Nesse contexto, a água para um fim mais nobre como o abastecimento humano, requer a satisfação de diversos critérios de qualidade. Em termos de avaliação da qualidade da água, os microorganismos assumem um papel de maior importância, devido à sua grande predominância em determinados ambientes, à sua atuação nos processos de depuração de despejos ou à sua associação com as doenças ligadas à água. O controle da população de bactéria é de fundamental importância, visto que densidades elevadas de microorganismos na água podem determinar a deterioração de sua qualidade com desenvolvimento de cor e sabor. A importância de sua determinação é no fato de ser um importante instrumento auxiliar no controle bacteriológico para avaliar as condições de higiene e de proteção de poços, fontes, reservatórios, piscinas e sistemas de distribuição de água para consumo humano.

As diluições da amostra são feitas para viabilizar a contagem de microorganismos posteriormente. Quando não se tem noção do numero de unidades formadoras de colônia em determinada amostra, fazem-se várias diluições (aproximadamente até 10-8, por exemplo), porém quando já se tem noção, faz-se inoculação em faixas de diluição determinadas (10-4 a 10-6, por exemplo, sempre de 3 em 3).

Conclusão

A portaria determina que na contagem não se deva ter quantidade maior que 500 unidades formadoras de colônias por ml de amostra. Acima disso a água está fora dos padrões de potabilidade. Saber essa quantidade é essencial para avaliar as condições sanitárias para o consumo e qualidade para tal. Uma das vantagens dessas técnicas é que somente são contabilizadas células vivas e também permite o isolamento das colônias, que podem ser sub-cultivadas em culturas puras, as quais podem ser facilmente estudadas e identificadas. Porém a necessidade de muita manipulação pode originar erro nas contagens devido a erros de diluição e/ou plaqueamento.

Referências Bibliográficas

- MICROBIOLOGIA, volume I, MICHAEL PELCZAR, ROGER REID, E.C.S. CHAN. Editora McGraw-Hill.

- VERMELHO, Aline Beatriz; PEREIRA, Antonio Ferreira; COELHO, Rosalie Reed Rodrigues; SAUTO-PADRÓN, Thais . Microbiologia. Guanabara. Rio de Janeiro: 2006.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO MATO GROSSO

FAET - FACULDADE DE ARQUITETURA, ENGENHARIA E TECNOLOGIA

DESA – DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL

RELATÓRIO DE MICROBIOLOGIA GERAL

Título: Contagem de microorganismos através das técnicas spread-plate e pour-plate.

Docente: Eduardo Beraldo de Morais

Discente: Paula Marques Ofugi

CUIABÁ

2010

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