Determinação de Coliformes

Determinação de Coliformes

Prof.ª Erika – Renato 3º E. T. Q. – Turma B

Luan nº 23 Maira nº 25 Richard nº 29

ARARAS – SP 2010

Capa1
Sumário2
PARTE I – TESTE PRESUNTIVO3

Objetivo Procedimento Resultados Discussão Conclusão

PARTE I – TESTE CONFIRMATIVO4
Objetivo5
Conclusão6
PARTE I – CONFIRMAÇÃO DE COLIFORMES FECAIS6

Introdução Procedimento Resultados Introdução

Procedimento7
Conclusão8

Objetivo Resultados Referências Bibliográficas

O teste presuntivo dos coliformes tem como característica e objetivo principal detectar a presença de coliformes na água. Nesse procedimento, usamos o caldo lauryl triptose, cuja concentração inicial do meio em cada tubo depende do volume das amostras.

A pesquisa de coliformes é baseada nas características do grupo bastonete que produzem ácidos e gás a partir da lactose, fazendo com que seja identificada ou não a presença de coliformes, devido a presença de gás no tubo de Duran após 24 horas na estufa bacteriológica á 35° C.

Preparar o meio de cultura (caldo lauryl triptose), utilizando 2,5 g para 70 ml de H2O d. Após preparar o caldo em um erlenmeyer de 250 ml, leve-o ao microondas por 30 segundos, tomando sempre cuidado para que não ocorra desnaturação protéica do caldo. Depois que o caldo atingir temperatura ambiente, verifique e corrija o pH próximo de 7,0 (neutro).

Para início de nossa pesquisa de coliformes, vamos utilizar 5 tubos de ensaio e mais 5 tubos de

Duran (um tubo de Duran para cada tubo de ensaio). Colocamos o tubo de Duran com a boca para baixo dentro do tubo de ensaio.

Pipetamos com a pipeta volumétrica 10 ml do caldo e colocamos nos tubos de ensaio, estando cientes de que não pode haver ar no tubo de Duran, e sim o caldo lauryl triptose, depois disso, tampe o tubo de ensaio com algodão para que possa ir á autoclave. Prepare as pipetas de 10 ml enrolando-as com jornal e organizando-as na autoclave juntamente com o caldo preparado e pipetado dentro dos tubos de ensaio.

Depois de esperar o tempo necessário para a autoclave esterilizar o material a ser trabalhado, cada grupo trabalhará com uma quantidade da água coletada á ser analisada, nesse caso 10 ml (mas as análises devem ser feitas com 20 ml, 10 ml, 1 ml e 0,1 ml para obter o número mais provável de coliformes levando em consideração a presença de coliformes em determinada quantidade de tubos, considerando a concentração). Com o material esterilizado, bancada limpa com álcool etílico 70%, usando devidamente os EPI’s (máscara, luvas, óculos de segurança, jaleco etc.) e bico de Bunsen ligado, vamos começar a preparar o nosso teste presuntivo.

Trabalhando sempre com o material perto do fogo, pipete do copo de Béquer 10 ml da amostra de água; passe a pipeta próxima ao fogo; e coloque no tubo de ensaio que já contém o caldo; feche o tubo; agite-o levemente e guarde-o na estante para tubo de ensaio. Faça o mesmo procedimento nos outros tubos de ensaio.

Após a preparação dos tubos de ensaio, higienize a estufa bacteriológica com álcool etílico 70%, coloque os tubos de ensaio na estufa á 35° C durante 24 horas. Após esse tempo, faça a leitura dos tubos, onde encontrar gás dentro do tubo de Duran significa que aquela amostra contém coliformes. Observe a imagem abaixo com gás no tubo de Duran, resultado positivo para coliformes. Os tubos que após 24 horas não deram positivos para coliformes devem ser reincubados durante mais 24 para fazer uma nova leitura e uma segunda confirmação dos resultados.

Na leitura, podemos considerar que os tubos de 10 ml, 1 ml e 0,1 ml deram o resultado positivo para coliformes. Com isso, utilizamos os resultados para saber o Número mais Provável (NMP) de coliformes em 100 ml de água, seguindo a tabela de NMP de coliformes, ou estimando pela fórmula de Thomas:

NMP/100 ml =Número de tubos positivos . 100 .

ml de tubos negativos . ml de todos os tubos

Os resultados obtidos são:

10 ml 1 ml 0,1 ml 5 + 5 + 0 + NMP = 240 coliformes 5 + 0 + 0 + NMP = 23 coliformes

Comparando os resultados, podemos observar uma grande diferença de coliformes nas análises. Isso pode ocorrer por determinados erros, onde são chamados de Erros Determinados, ou seja, erros que podem ser corrigidos; entre eles podemos citar a contaminação do meio, erro na técnica ou até mesmo erro na manipulação ou coleta da amostra.

Porém, os resultados encontrados podem nos mostrar que existem sim coliformes na água através do teste presuntivo. Agora será necessário o teste confirmativo, para confirmar a presença de coliformes na água em estudo.

Segue abaixo a tabela de NMP (Número mais provável de coliformes), onde foram encontrados os nossos resultados:

Número de tubos positivos NMP por 100 ml Limite de confiança de 95% 10 ml 1 ml 0,1 ml 100 ml Inferior Superior

Com o teste presuntivo de coliformes, conseguimos observar que realmente existem coliformes na água. Porém, não podemos afirmar que esses coliformes são fecais. Com resultado positivo na detecção de coliformes na água coletada, vamos para o teste confirmativo para saber se essa água em estudo tem a presença de coliformes já que o caldo lauryl triptose não tem o objetivo de inibir o crescimento de bactérias entéricas.

O grupo de bactérias determinado coliformes totais são aquelas que não causam doenças, visto que habitam o intestino de animais mamíferos inclusive o homem.

As bactérias do grupo coliforme são consideradas os principais indicadores de contaminação fecal. O grupo coliforme é formado por um número de bactérias que inclui os generos Klebsiella, Escherichia, Serratia, Erwenia e Enterobactéria. Todas as bactérias coliformes são gran-negativas manchadas, de hastes não esporuladas que estão associadas com as fezes de animais de sangue quente e com o solo. As bactérias coliformes fecais reproduzem-se ativamente a 4,5oC e são capazes de fermentar o açúcar.

O uso da bactéria coliforme fecal para indicar poluição sanitária mostra-se mais significativo que o uso da bactéria coliforme "total", porque as bactérias fecais estão restritas ao trato intestinal de animais de sangue quente. A determinação da concentração dos coliformes assume importância como parâmetro indicador da possibilidade da existência de microorganismos patogênicos, responsáveis pela transmissão de doenças de veiculação hídrica, tais como febre tifóide, febre paratifóide, desistiria bacilar e cólera.

O objetivo desse teste confirmativo é ter a certeza de que existem coliformes na água em estudo, já que o caldo lactosado bile verde brilhante, tem como objetivo de inibir o crescimento e desenvolvimento de bactérias, porém conservando e selecionando desta forma os coliformes.

Após a leitura do teste presuntivo, prepare o caldo lactosado bile verde brilhante, pesando 8 g do meio de cultura e diluindo-o. Corrigir o pH para 7,2 (neutro). Coloque durante 30 segundos no microondas tomando extremo cuidado para que não derrame o caldo causando uma desnaturação protéica.

Coloque o caldo na autoclave, juntamente com os tubos que deram positivos para a presença de coliformes no teste presuntivo. Aguarde a esterilização. Higienize a bancada para que não ocorra contaminação do meio.

Depois do material esterilizado, procure trabalhar sempre próximo ao fogo. Com a alça de platina, transfira uma alíquota de cada tubo positivo do teste presuntivo para os novos tubos de ensaio com tubos de Durham com o novo caldo que determinará os coliformes presentes na água em estudo.

Incubar os novos tubos com o caldo lactosado bile verde brilhante para o teste confirmativo na estufa bacteriológica, durante 48 horas a 35° C. Depois, fazer a leitura como positivos os tubos de Durham com gás, usando a tabela NMP de coliformes para obtenção do resultado de coliformes em 100 ml, ou estimar utilizando a fórmula de Thomas.

Os resultados do teste confirmativo estão selecionados abaixo:

10 ml 1 ml Total de tubos 5 + 5 + 10 NMP = 240 coliformes por 100 ml 5 + 0 + 5 NMP = 23 coliformes por 100 ml

OBSERVAÇÃO: Nesta análise, não foram utilizado os tubos de 0,1 ml, pois do teste presuntivo todos deram negativo para coliformes, e para a confirmação, foram utilizados somente tubos que haviam obtido o resultado positivo para coliformes no teste anterior.

Tubo de Durham com resultado positivo para coliformes. Resultado positivo para coliformes encontrando nos tubos de Durham presença de gás (setas).

Com relação à análise do teste presuntivo e do comparativo, podemos observar que o número de coliformes não se alterou. Mas devemos levar em conta que esses são resultados prováveis que podem ter um limite de confiança de 95%. Devemos lembrar também que alguns erros do teste presuntivo ou confirmativo, podem ter ocasionado um resultado ainda menos preciso.

Neste teste confirmativo, conseguimos identificar coliformes na água em estudo na mesma quantidade de coliformes por 100 ml no teste presuntivo. Porém, devemos levar em conta o Erro Determinado que pode ser gerados por vários fatores citados na primeira parte desse mesmo relatório.

Um outro grupo de bactérias freqüentemente relacionado à água é o grupo dos coliformes. Os coliformes fecais vivem no intestino dos animais como bois, porcos, cachorros, gatos, homens etc, sem lhes causar prejuízos. Eles são adquiridos quando penetram pela pele ou quando são ingeridos juntamente com a água ou alimentos contaminados e são constantemente liberados em grande quantidade, junto com as fezes.

Quando se faz a análise da água e se encontra contaminação por coliformes fecais significa que naquele local houve descarga de esgoto em período recente, o que aumenta a probabilidade de haver ali ovos e larvas de parasitas intestinais, visto que, estas formas também podem ser eliminadas com as fezes.

porque há um risco aumentado de contaminação

Desse modo, a presença de coliformes fecais, que são mais facilmente detectáveis em exames de rotina de laboratório do que as formas parasitárias, indica que a água não deve ser utilizada,

É necessário distinguir os coliformes fecais dos demais coliformes. Os coliformes fecais tem como ambiente natural locais com temperaturas elevadas, portanto, na estufa bacteriológica eles serão capazes de crescer a 4,5° C. Nesse teste, iremos avaliar o número de coliformes fecais.

Preparar o caldo Escherichia coli (EC), diluindo-o. Corrigir o pH para 6,9 (ácido-neutro).

Aquecer no microondas durante 30 segundos tomando cuidado para que não ocorra desnaturação protéica. Leve-o para a autoclave juntamente com os outros materiais necessário para esterilização. Trabalhando sempre perto do fogo, transfira com a ajuda de uma alça de platina, uma pequena porção de cada tubo positivo para os tubos contendo o caldo EC com os tubinhos de Durham.

Incubar durante 24 na temperatura 4,5° C. Fazer a leitura identificando como positivo os tubos de gás. Utilize a tabela de NMP de coliformes para saber a quantidade mais próxima de coliformes em 100 ml, ou estimar pela fórmula de Thomas.

Os 10 tubos de 10 ml e os 5 tubos de 1 ml deram resultados positivos para coliformes fecais. Os valores estão representados na tabela abaixo:

10 ml 1 ml Total de tubos 5 + 5 + 10 NMP = 240 coliformes fecais por 100 ml 5 + - 5 NMP = 23 coliformes fecais por 100 ml

Art. 4.º Para os fins a que se destina esta Norma, são adotadas as seguintes definições: VI - coliformes totais (bactérias do grupo coliforme) – bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de desenvolver na presença de sais biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose com produção de ácido, gás e aldeído a 35,0 ± 0,5ºC em 24-48 horas, e que podem apresentar atividade da enzima ß-galactosidase. A maioria das bactérias do grupo coliforme pertence aos gêneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora vários outros gêneros e espécies pertençam ao grupo;

VII - coliformes termotolerantes – subgrupo das bactérias do grupo coliforme que fermentam a lactose a 4,5 ± 0,2ºC em 24 horas; tendo como principal representante a Escherichia coli, de origem exclusivamente fecal;

Art.1. A água potável deve estar em conformidade com o padrão microbiológico conforme tabela 1, a seguir:

Na identificação de coliformes fecais, podemos concluir que todos os coliformes á cada 100 ml são coliformes fecais, tendo no primeiro resultado 240 coliformes fecais/100 ml e no segundo resultado 23 coliformes fecais/100 ml.

Talvez durante a manipulação dos caldos e das amostras, podem ter ocorrido algum tipo de contaminação microbiológica. Conseguimos então identificar a presença de diferentes coliformes no teste presuntivo e confirmatório; no teste de coliformes fecais, conseguimos concluir que todos os coliformes encontrados desde o inicio da análise eram coliformes fecais.

Como mostra o Art. 1. da portaria 518/2004 – Ministério da Saúde, em nenhum momento pode existir presença de coliformes fecais na água, desde a saída do tratamento até a distribuição da água, ou seja, essa água não faz parte da classe 1 de água, própria para consumo humano. Podemos também abranger esses resultados pela turbidez e quantidade de coliformes na água.

UNESP <http://w.ibb.unesp.br/departamentos/Educacao/Trabalhos/obichoquemedeu/bacteria_coliform es_fecais.htm> Acesso: 30 de Maio de 2010.

Laboratório de Ensino de Ciências e Tecnologia da USP < http://www.darwin.futuro.usp.br/site/ecologia/quadroteorico/c_coliformes.htm> Acesso: 30 de Maio de 2010.

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