VIII - Determinação de Lipídeos em Alimentos

1. Introdução

O termo lipídio é utilizado para gorduras e substâncias gordurosas. São definidos como compostos orgânicos do alimento (vegetal ou animal) que são insolúveis em água (solvente polar) e solúveis em solventes orgânicos (solventes apolares), tais como éter etílico, éter de petróleo, acetona, clorofórmio, benzeno e álcoois cujo teor é variável com o tipo de alimento (quadro 1). Estes solventes apolares extraem a fração lipídica neutra que

incluem ácidos graxos livres, mono, di e triacilgliceróis, e alguns mais polares como fosfolipídios, glicolipídios e esfingolipídios. Esteróis, ceras, pigmentos lipossolúveis e vitaminas, que contribuem com energia na dieta, podem ser extraídos apenas parcialmente.

Quadro 11. Alimentos e respectivos teores de gordura em percentagem (%)

PRODUTO TEOR DE GORDURA (%)

Manteiga e margarina 81 %

Molhos de salada 40 – 70 %

Leite fresco 3,7 %

Leite em pó 27,5 %

Sorvetes 12 %

Cereais 3 – 5 %

Carne 16 – 25 %

Peixes 0,1 – 20 %

Ovos 12 %

Chocolate 35 %

Frutas 0,1 – 1 % (abacate 26 %)

Vegetais 0,1 – 1,2 %

Fonte: CECCHI, H.M. (2003)

Os óleos e gorduras são ésteres e por isso devem ser derivados da reação de um ácido (ácidos graxos) e de um álcool (glicerol ou glicerina) produzindo também ao final da reação água. Os ácidos graxos são as unidades fundamentais da maioria dos lipídios. A diferenciação dos ácidos graxos se dá pela extensão da cadeia e a presença, número e posição de duplas ligações.

Em condições ambiente, as gorduras são sólidas devido à presença de grupos

saturados (ligações simples) e os óleos são líquidos por sua vez pela presença de insaturações (ligações duplas) na sua molécula.

A degradação de lipídios pode ser ocasionada por oxidação, hidrólise,

polimerização, pirólise e absorção de sabores e odores estranhos. Dentre estes fatores, a oxidação é a principal causa da deterioração de vários produtos, alterando diversas propriedades, como a qualidade sensorial (sabor, aroma, textura e cor), valor nutricional, funcionalidade e toxidez. Tais mudanças podem ter sua origem durante a produção, o processamento, a preservação, o armazenamento e o preparo do alimento. Muito embora a oxidação em geral se inicie na fração lipídica, eventualmente outros componentes são

afetados: proteínas, vitaminas e pigmentos. A oxidação de lipídios é um exemplo típico de reação envolvendo a formação de radicais livres.

As reações de oxidação são causadas pelo oxigênio atmosférico, menos

frequentemente pelo ozônio, peróxido, por metais e outros agentes oxidantes. Quanto maior o grau de insaturação maior será a suscetibilidade à oxidação.

O estudo inicia-se, com os testes relacionados para a caracterização destes

compostos e posteriormente os métodos de extração propriamente ditos.

2. Caracterização de Óleos e Gorduras

As determinações feitas na análise de óleos e gorduras são geralmente as dos

chamados índices, que são expressões de propriedades físicas ou químicas dos mesmos e não as percentagens dos seus constituintes. São índices que, juntamente com as reações características, servem para identificação e avaliação da maioria dos óleos e gorduras.

Quanto ao conhecimento da composição em ácidos graxos destes compostos o método de cromatografia gasosa é utilizado.

2.1 Índice de iodo

Método utilizado para determinar o grau de insaturação de um óleo ou gordura e para controlar alguns processamentos. Esse índice é baseado no fato de que o iodo e outros halogênios (F, Cl e Br) se adicionam numa dupla ligação da cadeia insaturada dos ácidos graxos.

O resultado do índice de iodo de um óleo ou gordura é definido como as gramas de iodo que são adicionadas em 100 g de amostra. É expresso em termos de iodo, independente de a reação ter sido com iodo ou outro halogênio. As gorduras menos insaturadas com baixo índice de iodo, são sólidas a temperatura ambiente, ou, inversamente, óleos que são mais insaturados, com maior índice de iodo, são líquidos. Outro ponto interessante e que quanto maior a insaturação e, consequentemente, maior o índice de iodo, maior será também a possibilidade de rancidez por oxidação. Basicamente, a determinação do iodo se dá por titulação com o tiossulfato de sódio

(Na2S2O3), usando amido como indicador. Existem dois métodos de determinação do índice de iodo: ICI (WIJS) e o IBR

(HANUS). O método de Wijs é o mais utilizado porque é mais exato, mas em

compensação o reagente de Hanus é mais estável.

2.2 Índice de saponificação –

É definido como o número de miligramas de hidróxido de potássio necessário para neutralizar os ácidos graxos resultantes da hidrolise completa de 1 g de amostra. Consiste em aquecer a amostra em banho-maria com solução alcoólica de hidróxido de potássio em refluxo, por 1 hora. Se junta fenolftaleína e titula-se o excesso de soda com o ácido clorídrico padronizado. Durante a saponificação é formado sabão. O índice de saponificação é uma indicação da quantidade relativa de ácidos graxos de alto e baixo peso molecular e não serve para identificar o óleo, pois muitos possuem índices muito semelhantes (188 – 196), entretanto, pode indicar adulteração destes compostos.

O índice de saponificação é inversamente proporcional ao peso molecular dos

ácidos graxos

2.3 Rancidez hidrolítica (deterioração da gordura)

A decomposição das gorduras constitui um dos mais importantes problemas

técnicos nas indústrias de alimentos Pode ocorrer de duas formas: rancidez hidrolítica (hidrólise da ligação éster por lipase e umidade) e rancidez oxidativa (autoxidação dos acilgliceróis com ácidos graxos insaturados por oxigênio atmosférico). Através da lipase é acelerada por luz e calor, com formação de ácidos graxos livres que causam sabores e odores desagradáveis, principalmente em gorduras como manteiga, que possui grande quantidade de ácidos graxos de baixo peso molecular. Em gorduras com ácidos graxos não voláteis, o sabor-odor característico não aparece juntamente com a deterioração. O procedimento para se determinar a rancidez hidrolítica está baseado na dissolução da gordura em um solvente misto e neutralizado, seguida da titulação com uma solução de NaOH, na presença de fenolftaleína como indicador. A rancidez oxidativa por sua vez tem como consequência à destruição das vitaminas lipossolúveis e dos ácidos graxos essenciais, além da formação de subprodutos com sabor-odor forte e desagradável.

Vários testes têm sido desenvolvidos para indicar a rancidez oxidativa em gorduras e entre eles cita-se: o índice de peróxido e o índice de TBA.

O índice de peróxido é determinado dissolvendo-se um peso de gordura em uma solução de ácido acético-clorofórmio, adicionando-se iodeto de potássio e titulando o iodo liberado com solução padrão de tiossulfato de sódio, usando amido como indicador. O resultado é expresso como equivalente de peróxido por 100 g de amostra. Para determinação do índice de TBA a amostra é dissolvida em solvente orgânico como: benzeno, clorofórmio ou tetracloreto de carbono e a extração do material reativo com uma solução de ácido-acético-ácido tiobarbitúrico-água. O extrato aquoso, com aquecimento, desenvolverá uma coloração vermelha se a gordura estiver oxidada podendo a cor ser medida no espectrofotômetro em absorvância.

3. Metodologias de extração de óleos e gorduras

3.1 Extração com mistura de solvente a frio

Método de Bligh-Dyer (1959)

Utiliza a mistura de três solventes, clorofórmio-metanol-água. A amostra é

misturada com o metanol e clorofórmio que estão numa proporção que formam uma só fase com a amostra. Adiciona-se mais clorofórmio e água promovendo a formação de duas fases distintas, uma de clorofórmio, contendo lipídios, e outra metanol mais água,

contendo substâncias não lipídicas. A fase do clorofórmio com a gordura é isolada e, após a evaporação do clorofórmio, obtém-se a quantidade de gordura por pesagem. O método tem uma série de vantagens em relação à extração a quente:

1) Extrai todas as classes de lipídeos, inclusive os polares que representam um alto teor em produtos de trigo e soja e são importantes para avaliações dietéticas;

2). Os lipídeos são extraídos sem aquecimento e os extratos podem ser utilizados para avaliação de deterioração dos lipídeos através do índice de peróxidos e ácidos graxos livres, além das determinações do teor de carotenóides, vitamina E, composição de ácidos graxos e esteróis.

3). Pode ser utilizado em produtos com altos teores de umidade, além dos produtos secos.

4). A determinação completa pode ser realizada em tubos de ensaio não

necessitando de equipamentos especializados e sofisticados.

3.2 Extração com solvente a quente

Está baseado em três etapas: a) extração da gordura da amostra com solvente; b) eliminação do solvente por evaporação; c) quantificação da gordura por pesagem. São utilizados dois tipos de equipamentos:

a) Soxlet: utiliza o refluxo do solvente sendo o processo é intermitente podendo ser utilizado somente com amostras sólidas.

Os dois solventes mais utilizados são o éter de petróleo e o éter etílico. O éter

etílico é um solvente de extração mais ampla, pois pode extrair também vitaminas esteróides, resinas e pigmentos, o que constitui um erro quando se deseja determinar somente gordura (triacilglicerídeos). Porém estes compostos aparecem geralmente em pequenas quantidades, o que daria um erro aceitável. Por outro lado, ele é menos usado porque é mais caro, perigoso e pode acumular água durante a extração que vai dissolver materiais não lipídicos. Portanto, o éter de petróleo é mais comumente utilizado.

b) Goldfish: o processo de extração é contínuo e mais rápido utilizado também para amostras sólidas. Tem a desvantagem do contato do solvente muito quente com a amostra, o que pode acarretar degradação da gordura.

3.3 Extração da gordura ligada a outros compostos

Em produtos como pão e leite, a gordura está ligada à proteína e carboidratos e, portanto, deve ser liberada para quantificação. Esta liberação é feita por hidrólise ácida ou alcalina.

3.3.1 Hidrólise ácida

Processo de Gerber

Utilizado somente para leite e produtos lácteos. A gordura presente no leite está em forma de emulsão de óleo e água, cercada de um filme de proteína. Este filme é rompido através do tratamento com ácido sulfúrico. Utiliza-se o álcool isoamílico para facilitar a separação da gordura e reduzir o efeito de carbonização do ácido sulfúrico sobre ela. Após a digestão, a amostra é centrifugada num tubo chamado butirômetro. A gordura

separada da fase aquosa com a proteína é medida volumetricamente diretamente no butirômetro De acordo com o IAL os lipídios em leite também pode ser medidos em aparelhos automáticos como o Milko-tester.

Existem vários tipos de butirômetros com escalas volumétricas diferentes, para

medir diferentes produtos lácteos, como creme de leite e queijos, e até para alguns produtos não lácteos, como produtos processados de carne e peixe.

Processo de Babcock –

Processo semelhante ao de Gerber, diferenciando nas quantidades de leite e ácido sulfúrico adicionados, e na adição de água quente em vez de álcool isoamílico. Ambos os métodos não determinam os fosfolipídios, mas não há problemas com o leite integral que tem apenas 1% de fosfolipídios na gordura total. O método de Gerber é 2 a 3 vezes mais rápido que o de Babcock.

3.3.2 Hidrólise alcalina

Método de Rose-Gottlieb e Mojonnier

A amostra é tratada com hidróxido de amônia e álcool para hidrolisar a ligação

proteína-gordura, e a gordura separada é então extraída com éter de petróleo e éter etílico. O álcool precipita a proteína que é dissolvida na amônia e a gordura separada pode ser extraída com éter. A extração com éter é muito eficiente em amostras com muito açúcar como, por exemplo, leite condensado e também pode ser empregado para laticínios em geral.

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