Genética Bacteriana

Genética Bacteriana

(Parte 1 de 3)

Genética Bacteriana o genoma bacteriano consiste no conjunto total de gen~s transportados pelas bactérias quer em seu cromossomo ou em seus elementos genéticos extracromossômicos, uan- do presentes. O cromos somo bacteriano difere do cromos- somo humano em vários aspectos. O cromos somo de uma bactéria típica como aEscherichia caliconsiste em uma única molécula de DNA circular, de filamrnto duplo, ~ontendo aproximadamente 5 milhões de pares de bases (ou 5.0 quilobase pares [kb]) medindo aproximadamente 1,3 m (isto é, cerca de 1.0 vezes o diâmetro da célula). Os menores cromos somos bacterianos (encontrados nos micoplasmas) possuem cerca de um quarto desse tamanho. Em

comparação, os seres humanos apresentam duas cópias de 23 cromossomos, que representam 2,9 X 109 pares de bases com 990 m de comprimento. Cada genoma contém muitos o érons, ue são constituídos or enes. Os eucariontes geralmente apresentam uas cópias distintas de cada cromos somo (eles são, por conseguinte, diplóides). As bactérias apresentam somente uma cópia de seus cromossomos elas são ha lóides). Considerando que as bactérias ossuem apenas um único cromossomo, a a teraçao do ene (mutação) Irá exercer um efeito mais óbvio sobre a cél a. ém isso, a estrutura do cromossomo bacteriano é mantidã referentemente por oliaminas, como a es ermina e a es ermidina, o ue or histonas. s actérias tam em contêm e ementos enéticos extracromossômicos como os plasmídios ou bacteriófaB:Js (vírus bacterianos). Esses elementos são independen- tes o cromossomo bacteriano e, em muitos casos, podem ser transmitidos de uma célula para outra.

Os genes são seqüências de nucleotídios com determinada função biológica; como exemplos temos os genes das proteínas estruturais (cístrons, que são genes codificado- res), genes do RNA ribossomal e sítios de reconhecimento e ligação para outras moléculas (promotores e operadores). Os promotores e operadores são seqüências de nucleotídios que controlam a expressão de um determinado ~e ao influencIar as sequencIas a serem transcntas emA mensageiro (RNAm) (ver discussão mais adiante).

Os opérons são grupos de um ou mais genes estruturais ex ressos a artir de um determinado romotor ue izam em um elemento ara o término da transcri ão.

Por conseguinte, todos os genes que codificam as enzimas de uma determinadil via podem ser coordenadamente regulados. Os opérons com muitos genes estruturais são policistrônicos. O opéron lac da E. cali inclui todos os genes necessários para o metabolismo da lactose, assim como os mecanismos de controle para desativar (na pre- . sença de glicose) ou ativar (na presença de galactose ou de indutor) esses genes somente quando necessários. O opéron lac inclui uma seqüência repressora, uma seqüên- cia promotora e genes estruturais para a enzima 13- galactosidase, uma permease, e uma acetilase (Fig. 5.1). O opéron lac será discutido posteriormente neste capítulo.

Repressor Beta-galactosidase Permease Aeetilase A0tl~1 z I~

RNAm I I ~RepressorB o_, _l~--z--I~

Nenhum RNAm lae

~~~~essor ~

Repressor

Indutor d ~9' alolactose Repressor t matlvo Transgalaetosldação

Lactose W T 1••1--_'\-- ATP

CAP AMPe Adenilato

>--•~~~ 0 O O ~Q)O

~ 0 eIndutor O Repressor o oW inativo CAP TAMPe ..•••••I--A-d-e~~-i1a-to-ATP

nos cromossomos filhos, cada um com seu par de forquilhas de crescimento para a síntese de novo DNA. A polimerase desloca-se ao longo do filamento do DNA, incorporando o nucleo- tídio apropriado (complementar) em cada posição. Areplicação se completa quando as duas forquilhas de replicação fazem um ângulo de 180 graus a partir da origem. O'processo de replicação do DNA exerce uma forte tensão de torcão sobre Q UNe cir- ~ular cromossomial; essa tensão é aliviada elas to oisomera-

~ por exemp o, girase).1 topoisomerase é essencial para as

Regulação da Expressão Gênica

As bactérias desenvolveram mecanismos para se adaptar rápida e eficientemente às mudanças de concentração de nutrientes em seu ambiente. Quando necessário, as bactérias ativam um conjunto completo de enzimas e evitam sintetizar a

Fig. 5.1A, O opéron da lactose é transcrito como RNAmensageiro (RNAm) policistrônico a partir de um promotor (P) e traduzido em três proteínas: ~-galactosidase (Z), permease (Y) e acetilase (A). O gene lac 1 codifica a proteína repressora. B, O opéron da lactose não é transcrito na ausência de um indutor alolactose, uma vez que o repressor compete com a RNA polimerase no sítio operador (O). C, O repressor, complexado com o indutor, não reconhece o operador devido a uma alteração de conformação no repressor. O opéron lac é então transcrito em um nível baixo. D, Escherichia coli crescendo em meio de cultura pobre, na presença de lactose como fonte de carbono. Tanto o indutor quanto o complexo CAP-AMPc estão ligados ao promotor, que está totalmente "ativado", e verifica-se um alto nível de transcrição e tradução do RNAm lac.E, O crescimento de E. coli em meio de cultura pobre sem lactose resulta na ligação do complexo CAP-AMPc à região promotora e na ligação do repressor ativo à seqüência do operador, uma vez que não há qualquer indutor disponível. O resultado será a ausência de trans- crição do opéron lac. CAP = proteína ativadora do gene catabólito; AMPc = adenosina monofosfato cíclico;ATP = adenosina trifosfato.

~nzima ou enzimas de determinada via quando o substrato está ausente. ~ primeiro lugar, a organização dos genes de uma via bioquímica em um opéron, com mecanismos de controle g,enético apropriados, permite a produção coordenada das t;,nzimas necessárias em resposta a um estímulo nutricional.

:gm segundo lugar, a transcrição do gene é regulada direta-

resfem resposta a sinais nutricionais no interior da célulaEm

mente pelas proteínas repressoras (que se ligam aos operadoterceiro lugar. a velocidade de síntese de proteína pelo ribos- somo pode regular a transcricãg QQ§ rrg,carionJ:,es. A ausência Qe uma membrana nuclear nos procariontes para separar os Q.ois processos permite ao ribossomo se ligar ao RNAm à medida que ele está sendo transcrito a partir do DNA.*

Regulação Transcricional

O início da transcrição pode estar sob controle positivo ou negativo. Os genes sob controle negativo são expressos"a

Múltiplas Forquilhas de Crescimento

1' Filamento líder

Fig. 5.2 Admitindo-se um tempo de 40 minutos para completar um ciclo de replicação e considerando-se um novo início a cada 20 minutos, o início da síntese do DNA precede a divisão celular. Múltiplas forquilhas de crescimento podem ser iniciadas na célula antes da completa formação do septo e divisão celular. As células filhas "nascem grávidas".

um aumento na freqüência de iniciação da transcrição. O complexo CAP-AMPc pode aumentar a transcrição do opéron através da interação proteína-proteína com a RNA polimerase ou através de uma interação proteína-DNA.

O o éron tri tofano (o éron contém os enes estrumrais necessários à iossíntese o triptofano e possui meçanismos de controle duplos transcricionais (Fig. 5.3). Embora o triptofano seja essencial para a síntese de proteínas, um excesso de triptofano na célula pode ser tóxico; conseqüentemente, ~ua síntese deve ser regulada. No nível de DNA, a roteína re ressora é ativada or um aumento da concentra-

~o intracelular do triptofano,.Jlara impedir a transcrição:l:i9 nível de síntese de roteína, a rá ida tradu ão de um" e tí- qio teste' no início do RNAm, na presença de triptofano, promove a formação de uma alça de filamento duplo no RNA,

Quefinaliza o processo de transcricão. A mesma alça é formada se não houver nenhuma síntese de proteína, uma situação em que não há necessidade de síntese de triptofano. Esse mecanismo re Ia a síntese do tri tofano no nível de RNAm em um processo enominado atenuação, no gual a síntese do RNAm é prematuramente finalizada.

Regulação Pós-transcricional ou Pós-tradução

A velocidade e a eficiência da síntese de proteínas podem ser controladas por outros fatores. Estes podem incluir a estrutura do RNAm ou as concentrações do RNA transportador

(RNAt) e de aminoácidos na célula. Com o RNAm policistrônico, o controle da tradução pode resultar em diferenças na quantidade de cada proteína expressa a partir de cada gene. Por exemplo, para o opéron lac, a l3-galactosidase, a galactosídio permease e a acetilase são produzidas à razão de 10:5 :2.

O DNA transmite a informação genética; conseqüentemente, as células devem ser capazes de replicar o DNA com pre- cisão. Além disso, lesões adicionais ao DNA devem ser minimizadas através da elabora ão de eficientes sistemas de reparo do DNA. fuses sistemas de contenção de esão são tão importantes para a vida de uma célula que uma bactéria deve edicar uma rande uantidade de seu enoma ara especific-ª!:e controlar as enzimas envo vi as nesse sistema.

Mutações que Afetam o DNA

Uma mutação se refere a qualql}er mudança na seqüência de bases do DNA. A alteração de uma única base pode resultar em uma transição, na qual uma purina é substituída por outra urina ou na ual uma irimidina é substituída or outra eirimidina. Po e também ocorrer uma transversão, niLqual, por'exemplo, uma purina é substituída por uma pirimidina e yice-versa. Uma mutação silenciosa é uma alteração no nível de DNA que não resulta em qualquer mudança de aminoácido na proteína codificada. Esse tipo de mutação ocorre porque mais de um códon pode codificar um aminoácido. Uma mutàção de sentido equívoco resulta na inserção de um aminoácido diferente na proteína, mas essa pode ser ~a muta ão conservativa se o novo aminoácido a resenta ro- 12..riedadessemelhantes (por exemp o, va ina substituindo a

Fosforribosil ontroniloto isomerose/indol 3-glicerol-fosfato sintetase

Triptofono sintetase alfa

Fosforribosil antronilato tronsferase

Triptofano sintetase beta Repressor

! Repressor 1 ~inativo r · 8. Repressor . ativo

OCo-repressor (triptofano)

BBaixa concentração de Trp

A Alta concentração de Trp

Nenhum RNAm trp policistrônico

RNAm trp policistrônico

C Ausência de síntese de proteína

Nenhum RNAm VJ...AJ trp policistrônico alanina). Fina mente uma muta ão sem sen .do modifica o ,çódon gue codifica um aminoácido em um có on je terminalização (por exemplo, TAG [timidina-adenina-guanina]), &zendo com que o ribossolllQ se desprenda do RNAm e

Ill\ralise prematuramente a síntese da proteína.

Podem ocorrer alterações mais drásticas nas proteínas quando estão envolvidas várias bases. Por exemplo, uma pe- quena depleção ou inserção que não é em múltiplos de três produz uma mutação por deslocamento do quadro de leitura. Em conseqüência, ocorre uma alteração na estrutura de leitura, resultando geralmente em um peptídio sem sentido e

Fig. 5.3 Regulação do opéron do triptofano (trp). A, O opéron trp codifica as cinco enzimas necessárias para a biossíntese do triptofano. Esse opéron trp se encontra sob duplo controle. B, A conformação da proteína repressora inativa é alterada após a sua ligação pelo triptofano co-repressor. O repressor ativo (R) resultante se liga ao operador (O), bloqueando qualquer transcrição do RNAm do trp pela RNA polimerase. C, O opéron trp também está sob o controle de um mecanismo de atenuação-antiterminação. Acima dos genes estruturais estão o promotor (P), o operador e um líder (L), que pode ser transcrito em um pequeno peptídio contendo dois triptofanos (IV) próximo à extremidade distal. O RNAm líder possui quatro repeti- ções (1, 2,3 e 4) que podem formar pares diferentes de acordo com a disponibilidade do triptofano, resultando em terminação precoce da transcrição do opéron trp ou em sua transcrição completa. Na presença de alta concentração de triptofano, as regiões 3 e 4 do RNAm líder podem formar pares, originando um grampo de terminação, não ocorrendo nenhuma transcrição do opéron trp. Entretanto, na presença de pouco ou nenhum triptofano, os ribossomos permanecem na região 1 durante a tradução do peptídio líder, devi- do à seqüência dos códons do triptofano. Em seguida, as regiões 2 e 3 podem parear, formando o grampo de antiterminação e levando à transcrição dos genes trp. Finalmente, as regiões 1:2 e 3:4 do RNAm líder podem parear, acarretando também a paralisação da transcrição antes do primeiro gene estrutural trpE. A= adenina; G = guanina; T = timina.

em truncamento prematuro da proteína. As mutações nulas, que destroem completamente a função gênica, surgem uando ocorrem extensa inser ão deleção ou rearran'o pronunciado na estrutura do cromossomo. A inserção de longas seqüências e N muitos milhares de pares de bases) por. recombinação, transposição ou durante a engenharia genética pode produzir mutações nulas ao separar as partes de um gene, inativando-o.

Muitas mutações ocorrem espontaneamente na natureza (por exemplo, por erros da polimerase); entretanto, as mutações podem também ser induzi das por agentes físicos ou químicos. Entre os agentes físicos utilizados para induzir mutações em bactérias temos o calor, que resulta na desaminação dos nucleotídios; a luz ultravioleta, que induz a formação de dímeros de pirimidina; e a radiação ionizante, como os raios X, que originam radicais hidroxila muito reativos que podem ser responsáveis pela abertura de um anel de uma base ou por quebras de filamentos simples ou duplos no DNA.

Os agentes químicos mutagênicos podem ser agrupados em três classes. A primeira classe é constituída pelos análogos de bases nucleotídicas; eles são incorporados ao DNA durante a replicação e acarretam pareamento equívoco e freqüentes erros durante a replicação do DNA. A semelhança entre 05- bromouracil e a timidina permite a sua incorporação ao DNA.

Entretanto, um rearranjo estrutural da molécula permite a ligação do 5-bromouracil à guanina em vez da adenina, alterando o par de bases T-A para G-c.

A segunda classe é constituída por moléculas planas policíclicas, como o brometo de etídio ou os derivados da acridina; constituem exemplos de substâncias que induzem mutação por deslocamento do quadro de leitura. Inserem-se (ou inter- calam-se) entre as bases à medida que elas se empilham na dupla hélice, causando a adição ou a deleção de uma única base. Esses agentes de intercalação aumentam o espaçamento entre sucessivos pares de bases destruindo o esqueleto regular de açúcar-fosfato e diminuindo o espaço entre as voltas da hélice. Essas alterações levam a erros freqüentes durante a replicação do DNA. A terceira classe é constituída por substâncias químicas

capazes de reagir com o DNA; elas atuam diretamente sobre o DNA, resultando na modificação da base normal em outra estrutura quimicamente diferente. As bases modificadas podem fazer pareamentos anormais ou não fazer qualquer pareamento. O dano pode causar a remoção da base do arcabouço do DNA. Essa classe inclui o ácido nitroso (HNO) e agentes alquilantes, como a nitroso guanidina e o sulfonato de etilmetano que são conhecidos por adicionarem grupos meti! ou etil aos anéis das bases do DNA.

A base lesada é reconheci- pelo glicosilase, que diva a li· Uma endonudease APrec~ da pela endonuclease, que gação entre o açúcar do nhece o sítio AP e c1iva o c1ivao arcabouço fosfodiés- nucleotídio e o arcabouço fos- arcabouço fosfodiéster próter em ambos os lodos fodiéster ximo ao local da base au· da lesão sente

(Parte 1 de 3)

Comentários