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40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 química de proteínas tem passado por um novo período de grandes avanços tecnológicos e científicos. Com a conclusão do seqüenciamento dos genomas de vários organismos, inclusive o da espécie humana, a pesquisa envolvendo proteínas ganhou novo fôlego e entramos em uma nova fase conhecida como pós-genômica, em virtude da sua estreita relação com os dados produzidos pelas pesquisas genômicas. Essa fase tem-se caracterizado pelo domínio de um novo método analítico empregado no estudo de proteínas: a espectrometria de massa, simbolizada por MS — do nome em inglês mass spectrometry.

Princípios da espectrometria de massa

A espectrometria de massa é um método de determinação precisa de massas molares. Há várias décadas, esse método vem-se consolidando como ferramenta insubstituível para a determinação de estruturas químicas, principalmente de compostos orgânicos pequenos e voláteis. Durante a década de 1980, foram desenvolvidos novos mecanismos de ionização em espectrômetros de massa para moléculas grandes e polares como peptídios e proteínas, até então impossíveis de serem analisados por essa técnica, o que permitiu que vários problemas bioquímicos pudessem ser resolvidos.

Um espectrômetro de massa é formado basicamente de duas partes: o sistema de ionização das moléculas, responsável por vaporizá-las e carregá- de massa de proteínasPesquisa O papel-chave da espectrometria de massa na era pós-genômica las eletricamente, e o analisador de massa — o espectrômetro de massa propriamente dito — que separa os íons resultantes de acordo com a massa. Atualmente, duas técnicas de ionização (Figura 1), que se complementam e se sobrepõem, dominam a análise de proteínas: a dessorção a laser e a eletropulverização.

Dessorção a laser

A palavra dessorção (desorption, em inglês) refere-se ao fenômeno de retirada de substâncias adsorvidas ou absorvidas por outras. No caso da espectrometria de massa, a proteína — ou a mistura protéica ou peptídica

— em estudo é misturada a uma matriz ácida e irradiada com um feixe de laser, cuja energia causa a dessorção da molécula. A matriz ácida transfere prótons para as moléculas de proteína, fazendo que fiquem ionizadas positivamente. A dessorção das moléculas de matriz e de proteína faz que elas passem para o estado gasoso. Estar na forma ionizada e no estado gasoso é condição para que uma molécula possa ser analisada por espectrometria de massa. A principal técnica empregada na análise de proteínas baseada no fenômeno da dessorção a laser é conhecida como MALDI — sigla em inglês para matrixassisted laser desorption ionization.

Eletropulverização

Na ionização por eletropulverização, a proteína é dissolvida em uma solução acidificada a qual é pulverizada em uma agulha metálica — ou um

Ricardo Bastos Cunha

Prof. Dr., Núcleo de Proteômica, Centro Brasileiro de Serviços e Pesquisas em Proteínas; Divisão de Química Analítica Instituto de Química

Universidade de Brasília Brasília/DF rbcunha@unb.br

Mariana de Souza Castro

Profa. Dra., Núcleo de Proteômica, Centro Brasileiro de Serviços e

Pesquisas em Proteínas Universidade de Brasília

Brasília/DF mscastro@unb.br

Wagner Fontes

Prof. Dr., Núcleo de Proteômica, Centro Brasileiro de Serviços e

Pesquisas em Proteínas Universidade de Brasília

Brasília/DF wagnerf@unb.br

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 41 capilar de vidro revestido de metal — submetida a intenso campo elétrico, o que causa sua ionização. Uma corrente de gás inerte flui no sentido contrário ao da pulverização, o que causa sua dessolvatação. A proteína, já ionizada e no estado gasoso, é atraída para dentro do espectrômetro de massa, onde é analisada. O termo ESI — sigla em inglês para electrospray ionization — é comumente empregado para designar tal técnica.

Analisadores de massa

Os principais analisadores de massa (Figura1) que acompanham os sistemas de ionização descritos são: •tempo de vôo — abrevia-se como TOF, sigla em inglês para timeof-flight — sistema em que molécu- las ionizadas e aceleradas são lançadas em um tubo sob vácuo e sem campo elétrico para medida do seu tempo de vôo até um detector. Esse tempo de vôo é proporcional à massa molar da molécula. Este analisador é usualmente associado à dessorção a laser; mas pode também ser utilizado com eletropulverização; •quadripolo, que utiliza a condução de moléculas ionizadas entre quatro cilindros metálicos conectados a fontes de radiofreqüência para fazer que determinados grupos de íons cheguem ao detector. Esse analisador geralmente é usado com eletropulverização, mas pode estar associado também à dessorção a laser. •aprisionamento de íons — abrevia-se como IT, sigla em inglês para ion trap — em que as moléculas também são conduzidas para dentro de um compartimento onde exis- te um forte campo eletromagnético. Diferentemente do quadripolo, nesse sistema os íons não são perdidos em sua trajetória rumo ao detector. Ao contrário, eles são aprisionados no compartimento onde existe campo eletromagnético e liberados um a um. Esse analisador associa-se tanto à eletropulverização quanto à dessorção a laser.

A espectrometria de massa é uma técnica capaz de determinar massas molares de forma muito precisa em experimentos rápidos (poucos minutos). Essas informações possibilitam a resolução de diversos problemas em química de proteínas, tais como: checagem da correção de uma seqüência de aminoácidos, identificação de proteínas, determinação da

Figura 1 - Técnicas de ionização e tipos de analisadores de massa: A) eletropulverização (ESI), mostrando a agulha de pulverização, os filtros iniciais que impedem a progressão de partículas não-ionizadas e o início de um sistema de quadripolos; B) quadripolos em um sistema de triplo quadripolo, esquematizando partículas conduzidas ao detector à esquerda; C) dessorção a laser (MALDI) ilustrando um pulso de laser incidindo sobre a amostra aplicada na placa retangular e gerando partículas ionizadas. À esquerda das partículas são mostrados filtros eletrônicos que impedem a passagem de partículas não-ionizadas para o analisador TOF; D, E e F) analisador tipo TOF no modo refletor (reflectron), apresentando todo o tubo de vácuo com os íons no início da trajetória (D), a mudança de trajetória no refletor (E) e a chegada ao detector após o refletor – acima, no tubo estreito (F)

42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 fidelidade e homogeneidade de proteínas recombinantes, identificação de complexos protéicos nãocovalentes, detecção de doenças genéticas, identificação de modificações químicas em proteínas, determinação de glicosilações — adição de açúcares à molécula de proteína — e fosforilações — adição de fosfatos à molécula de proteína —, seqüenciamento de proteínas e peptídios etc. As possibilidades de aplicação da espectrometria de massa não se esgotam aqui. Existem vários outros usos dessa nova tecnologia relacionados à biotecnologia e a áreas correlatas. Aplicações que envolvem análise de carboidratos, lipídios e ácidos nucléicos estão se tornando rotina também. A seguir são relacionadas algumas aplicações da espectrometria de massa em química de proteínas.

Determinação precisa da massa molar de proteínas

A espectrometria de massa é uma das técnicas analíticas mais precisas existentes. Consegue-se facilmente 5 ou 6 algarismos significativos nas medidas de massa molar, com erros que podem chegar a apenas 0,001 % em equipamentos de alta resolução. A título de compara- ção, na eletroforese em gel, técnica ainda muito utilizada para separação de misturas protéicas e medidas de massas molares de proteínas, conseguem-se erros de no mínimo 5 %. A precisão dos espectrômetros de massa é tanta que é possível distinguir duas moléculas de 10.0 u que diferem entre si pela presença de apenas 1 carbono-13 (13C) na molécula — o carbono-12 (12C) é o isótopo mais abundante na natureza. A espectrometria de massa é, portanto, entre todas as técnicas existentes, a que possibilita a determinação mais precisa da massa molar de proteínas e peptídios.

Checagem da pureza de proteínas e peptídios

O estado de pureza de proteínas e de peptídios é um aspecto extremamente importante em química de proteínas. A checagem dessa pureza pode ser feita utilizandose a espectrometria de massa. De maneira geral, a existência de um pico único em espectros de MALDI ou no espectro reconstruído de ESI indica a presença de apenas uma forma molecular. A presença de dois ou mais picos demonstra a existência de isoformas ou de contaminantes.

A checagem de pureza por espectrometria de massa é um mé- todo consideravelmente mais sensível e, devido a sua grande precisão, bem mais fidedigno que outros métodos existentes, como a cromatografia líquida — HPLC, sigla em inglês para high performance liquid chromatography — e a eletroforese.

Identificação de isoformas protéicas

Isoformas protéicas são proteínas que têm a mesma função, mas são codificadas por genes distintos e apresentam pequenas diferenças em sua seqüência. Por exemplo, o fator de transformação beta (TGF-B) existe em três versões ou isoformas (TGF-B1, TGFB2, e TGF-B3), cada uma delas é capaz de disparar uma cascata de sinalização que começa no citoplasma e termina no núcleo da célula. Essas isoformas são bastante difíceis de separar pelos métodos usuais utilizados na purificação de proteínas. Sua presença pode ser demonstrada por meio da espectrometria de massa, desde que suas massas molares sejam distintas. A ocorrência de um pico único cromatográfico que produza dois picos distintos e próximos em um espectro de massa sugere a presença de isoformas protéicas, que pode ser confirmada por meio de técnicas de identificação de proteínas (ver adiante).

Confirmação da seqüência completa de aminoácidos

Se a massa molar calculada a partir de uma seqüência de aminoácidos de uma proteína ou peptídio, determinada experimentalmente, for igual àquela determinada por espectrometria de massa, pode-se concluir que a seqüência em questão está correta. Cabe ressaltar que a existência de aminoácidos isobáricos, ou seja, aminoácidos que possuem a mesma massa molar ou massas molares muito próximas —

Figura 2 - Seqüenciamento por espectrometria de massa (CID-MS/MS). O espectro de MS/MS é rico em informações de seqüência. A diferença de massa entre os diversos picos pode auxiliar na dedução da seqüência do peptídio, uma vez que as ligações preferencialmente clivadas pelo processo CID são as peptídicas. Espera-se obter, em um espectro de MS/MS, picos correspondentes às fragmentações da cadeia peptídica em diferentes posições, determinando as séries A, B, C, X, Y e Z, cujas massas auxiliam na dedução da seqüência do peptídio. Na figura, foram ilustradas as séries B e Y, correspondentes aos fragmentos provenientes da fragmentação apenas das ligações peptídicas by 1y 7

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 43 cuja diferença é inferior ao erro da medida —, deixa certa dúvida a respeito da seqüência correta. Porém, a comparação com seqüências similares ou mesmo com a seqüência do gene pode minimizar essas dúvidas.

Confirmação da correção da expressão de proteínas recombinantes

A tecnologia de DNA recombinante é hoje muito utilizada na indústria da biotecnologia. Tratase de uma série de procedimentos usados para juntar-se (recombinar) segmentos de DNA com determinado objetivo biotecnológico. A correção da expressão de proteínas recombinantes pode ser avaliada por meio da determinação exata de suas massas molares utilizando-se espectrometria de massa. Essa técnica pode ser utilizada no controle de qualidade da fidelidade da expressão gênica e pureza do material obtido, uma aplicação particularmente útil para a indústria da biotecnologia.

Determinação de modificações pós-traducionais

A maioria das proteínas, após ser sintetizada — ou seja, traduzida —, sofre modificações póstraducionais. Uma das maneiras mais comuns em que uma proteína é modificada é pelo processo de glicosilação, no qual oligossacarídeos são ligados a sítios específicos da cadeia polipeptídica. Mais de 60 % das proteínas naturais são glicosiladas. Açúcares ligados à estrutura de proteínas podem auxiliar no enovelamento correto da proteína, servir de epitopos de reconhecimento de anticorpos, servir como uma capa de proteção contra a ação de proteases ou exercer um papel na localização e na orientação de proteínas da membrana celular, apenas para citar alguns exemplos. A espectrometria de massa tem sido extensivamente utilizada para determinação do conteúdo de carboidratos em glicoproteínas, para localização de sítios de glicosilação e até para determinação de estruturas glicídicas.

A fosforilação de uma proteína é uma das mais importantes modificações pós-traducionais com efeito direto na atividade celular. A maioria dos processos metabólicos em uma célula eucariótica são regulados em certos pontos pela fosforilação de uma ou mais proteínas-chave. A regulação da transcrição genética, a progressão do ciclo celular, a proliferação, a divisão e a diferenciação celular, a dinâmica citoesquelética e a estocagem e recuperação de energia são todos processos dependentes de fosforilação. A identificação de sítios específicos de fosforilação é uma etapa importante em direção ao entendimento das vias de sinalização intracelulares. Cada vez mais esse trabalho tem sido conduzido por meio da espectrometria de massa.

Os aminoácidos que são normalmente fosforilados são a serina, a treonina e a tirosina, embora fosforilações em resíduos de histidina e ácido aspártico também sejam descritas. Se a seqüência completa de aminoácidos da proteína fosforilada for conhecida, os sítios de fosforilação podem ser determinados simplesmente analisando-se a mistura peptídica obtida de um digesto enzimático por espectrometria de massa. Os peptídios com massa de 98 u — resultante da adição de

H3PO4 — acima do esperado pela seqüência estão fosforilados.

Seqüenciamento de proteínas por MS/MS

Trabalhos de seqüenciamento por espectrometria de massa são conduzidos normalmente em equipamentos conjugados, ou seja, que possuem pelo menos dois analisadores de massa. Tais equipamentos associam dois analisadores de massa em série e, por isso, a técnica é conhecida como MS/MS — por alusão à espectrometria de massa (MS, sigla em inglês para mass spectrometry) seguida de outra espectrometria de massa. Equipamentos típicos de MS/MS incluem espectrômetros de eletropulve- rização com triplo quadripolo ou com um quadripolo e um analisador TOF (Q-TOF), equipamentos do tipo aprisionamento de íons (ion trap) e equipamentos com ionização do tipo MALDI com dois analisadores TOF (MALDI-TOF-TOF).

Nesse tipo de análise, uma amostra de peptídio puro ou mesmo uma mistura de peptídios obtidos por digestão enzimática é injetada no espectrômetro de massa. No caso mais complexo de mistura de peptídios, um peptídio de interesse é selecionado no 1º filtro de massa, introduzido e acelerado em uma câmara de colisão, onde existe uma corrente gasosa de um gás inerte, como nitrogênio ultrapuro. As colisões entre as moléculas do íon peptídico e do gás inerte provocam a fragmentação da cadeia polipeptídica. Esse fenômeno é chamado de dissociação induzida por colisão — CID, sigla em inglês para collision induced dissociation. As ligações mais lábeis são justamente as ligações peptídicas, seguidas pelas demais ligações da cadeia principal. Assim, um espectro dessa fragmentação é rico em informações de seqüência (Figura 2). Existe uma nomenclatura para descrever os diversos fragmentos peptídicos passíveis de serem obtidos por CID-MS/ MS (Figura 3), que auxilia na interpretação dos espectros de MS/MS.

As vantagens do seqüenciamento por MS/MS em relação aos métodos químicos incluem a grande rapidez — um experimento de MS/ MS pode ser feito em menos de 5 min, o mesmo trabalho em um seqüenciador automático pode demorar até dois dias —, o baixíssimo custo — enquanto o seqüenciamento químico utiliza diversos reagentes de alto custo, a técnica de MS/MS gasta praticamente somente nitrogênio — e a grande sensibilidade — seqüenciamento químico na ordem de picomol; MS/MS na ordem de femtomol. As desvantagens são a difícil interpretação dos espectros — os resultados não costumam ser tão claros como no seqüenciamento químico — e a grande dificuldade para se distinguir os aminoácidos isobáricos

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