microcopia optica e coloração de gram

microcopia optica e coloração de gram

UFPB- Universidade Federal da Paraíba

CT- Centro de Tecnologia

Departamento de Tecnologia e Química de Alimentos

Relatório de Microbiologia I

Aluna:

Profª.:

Microscopia e Coloração de Gram

1.Introdução

O microscópio óptico é aquele comumente utilizado em laboratórios de microbiologia. Seu princípio se baseia no aumento de imagem por um jogo de lentes,associado a uma forte iluminação do campo de observação e da visão translúcida do microrganismo.

Geralmente os microscópios desse tipo permitem um aumento útil de aproximadamente mil vezes. A maioria é equipada com três objetivas: objetiva de imersão,Objetiva a seco de grande aumento e objetiva a seco de pequeno aumento.A essas objetivas correspondem oculares que em geral permitem um aumento de dez vezes.O aumento total permitido pelo microscópio é fornecido pela multiplição do poder de aumento da objetiva pelo da ocular. Com algumas modificações,com o uso das oculares de poder mais alto,essa ampliação pode ser aumentada duas ou três vezes.Contundo, o aumento de mil a 2 mil vezes é o limite da ampliação útil obtida no microscópio óptico. A limitação não é uma questão de aumento, mas sim do poder de resolução,ou seja, a capacidade de distinguir distinta e separadamente dois pontos adjacentes. O poder de resolução é função do comprimento de onda de luz visível utilizada (quatrocentos a setecentos manômetros, dependendo do filtro) e da abertura numérica,que é uma característica do sistema de lentes utilizado. O limite de resolução é obtido com o menor comprimento de onda da luz visível e com objetiva de maior abertura numérica.

Pode-se então concluir que se deve iniciar a observação microscópica utilizando pequenas ampliações, que permitam captar uma idéia de conjunto. A preparação deve ser percorrida nos vários sentidos a fim de se localizar a zona de maior interesse. Dessa zona seleciona-se os elementos de maior importância, centrando-os, e só depois se deve passar a objetivas de poder ampliador maior. Estas permitirão observar detalhadamente os pormenores desejados da preparação em causa.

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.

O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.

A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.

2. objetivos

O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade.

Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-positivas, células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.

O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituída pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-acetona pode ser substituído por álcool 95%.

A técnica da coloração de Gram não é infalível e pode-se fazer o teste do hidróxido de potássio (KOH). Em um lâmina de microscopia adicionam-se duas gotas de uma solução de KOH a 3%. Com o auxílio de uma alça de semeadura coleta-se uma colônia isolada da bactéria a ser testada e mistura-se com a solução de KOH na lâmina por 30 segundos. Durante a mistura deve-se erguer a alça de semeadura cerca de 1 a 2 cm da superfície da lâmina observando-se se há fios de material viscoso pendentes. Se a bactéria for verdadeiramente Gram-negativa, o KOH irá romper sua parede celular e liberar seu DNA que será observado como fios viscosos. Se a bactéria for Gram-positiva não haverá a formação de fios.

2. Objetivos

Demonstrar a importância desta coloração e estabelecer a distinção entre:

  • Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas;

  • As morfologias cocos ou bacilos;

  • Arranjos bacterianos (estafilococos, estreptococos, estreptobacilos, etc) .

3. Método

3.1 - Preparo do esfregaço

Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0,85%, sobre uma lâmina de microscópio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen.

3.2 - Aplicação do corante primário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante cristal violeta; deixar em repouso por um minuto. Descartar o excesso de corante ou enxaguar a lâmina com água.

3.3 - Aplicação do fixador

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com lugol; deixar em repouso por um minuto. Descartar o excesso do fixador ou enxaguar a lâmina com água.

3.4 - Descoloração

Com a lâmina inclinada, despejar algumas gotas de álcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para remover o complexo cristal violeta-lugol de células Gram-negativas. Este procedimento não pode exceder a cinco segundos, pois o descolorizador poderá remover o corante cristal violeta das células Gram-positivas. Em seguida, enxaguar a lâmina com água para remover excesso de solvente.

3.5 - Aplicação do corante secundário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante fucsina básica; deixar em repouso por um minuto. Enxaguar a lâmina com água e tocar as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.

3.6 - Microscopia

Examinar a amostra ao microscópio óptico. Na aplicação da técnica de coloração de Gram de organismos desconhecidos, pode-se utilizar como controles uma bactéria Gram-positiva e uma Gram-negativa, conhecidas, preparando-se lâminas com três esfregaços, sendo o esfregaço central o da bactéria desconhecida. Desta forma, as bactérias controles indicarão se a técnica foi ou não bem sucedida.

4. Ampliação e resolução do microscópio óptico e luminoso

Há um limite mínimo para a dimensão dos objectos que podem ser observados com um determinado sistema óptico, limite esse que se denomina resolução do sistema. Por exemplo, a resolução do olho humano é de cerca de 0,2mm, e é determinada pela estrutura celular da retina. A de um microscópio óptico é de 0,2m e é limitada pelo comprimento de onda da luz visível. A ampliação da imagem produzida pelo sistema óptico, permite observar objectos de dimensões inferiores a 0,2 mm (resolução do olho humano), mas apenas até ao limite de resolução do sistema óptico. Objectos menores que este limite não podem formar imagens, por maior que seja a ampliação utilizada.

A ampliação útil é a ampliação necessária para que a imagem do objecto se torne visível, ou seja, para que atinja dimensões iguais ou superiores ao limite de resolução do olho humano. Para conforto do observador, as imagens são ampliadas até dimensões que tornam a sua observação confortável. O factor de ampliação adicional é a ampliação vazia. Exemplo: Para que um objecto no limite de resolução do microscópio óptico se torne visível é necessário ampliá-lo: 0,2mm / 0,2 µm = 200 µm / 0,2 µm = 1000 x. Para uma observação confortável, podemos ampliá-lo até 1mm, utilizando um factor de ampliação adicional de 1mm/0,2mm=5.

Vê-se assim que a ampliação útil de um microscópio óptico não excede as 1000x

4.1 Tipos de Microscópios

O limite de resolução de um microscópio depende do comprimento de onda da radiação electromagnética usada para formar a imagem e de aberrações das lentes . Deste modo, pode-se melhorar a resolução construindo microscópios que utilizem radiações de comprimento de onda menor que o da luz visível. A construção deste tipo de microscópios depende da capacidade de produzir lentes para a radiação em causa. A radiação ultra-violeta permite algum ganho de resolução, mas é usada principalmente nos microscópios de fluorescência. Os raios-X começam a poder ser usados com lentes especiais, e raios-gama não foram ainda usados por falta de dispositivos que possam funcionar como lentes. Os raios catódicos (feixes de electrões) utilizam lenteselectromagnéticas e são usados nos microscópios electrónicos.

Existem variações importantes no modo como se processa a interacção do feixe de radiação com a amostra. Nos microscópios de transmissão, o feixe de radiação atravessa a amostra. Nos microscópios de reflexão o feixe incide sobre a amostra sem a atravessar. No primeiro caso, a amostra tem de ser permeável ao feixe de radiação, o que pode exigir métodos de preparação complexos. No segundo, a amostra é geralmente uma peça opaca e o que se observa é a sua superfície.

Nos microscópios mais comuns, o feixe de radiação é estático e irradia simultaneamente toda a área observável da amostra. Noutros aparelhos (microscópios de varrimento), o feixe possui dimensões muito reduzidas irradiando apenas um ponto da amostra, e é dotado de um movimento relativamente àquela, irradiando em sequência todos os pontos do objecto (varrimento ou varredura).

Estas várias características podem ser combinadas, como por exemplo nos microscópios de varrimento - transmissão, em que o feixe pontual varre e atravessa a amostra.

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5.Conclusão

O microscópio óptico é um instrumento usado para ampliar, com uma série de lentes, estruturas pequenas impossíveis de visualizar a olho nu. É constituído por um componente mecânico que suporta e permite controlar um componente óptico que amplia as imagens.

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis.

6. Bibliografia

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