REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA - PCR

O QUE É PCR?

  • É uma metodologia que se baseia na amplificação exponencial seletiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma única célula, sem o uso de um organismo vivo.

HISTÓRICO

  • Karys Mullis descreveu a PCR no final da década de 1980.

  • Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo .

  • O Prêmio Nobel da Química foi atribuído à Karys Mullis pelo seu trabalho em 1993.

  • Atualmente, método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas.

PARA QUE SERVE A PCR?

  • Diagnóstico médico;

  • Mapeamento genético;

  • Detecção de doenças hereditárias;

  • Clonagem de genes;

  • Testes de paternidade;

  • Criação de organismos transgênicos;

PARA QUE SERVE A PCR?

  • Medicina Forense:

    • pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting.

PROCEDIMENTOS

  • Devem ser realizados com o maior cuidado para evitar contaminações que possam alterar o resultado.

  • Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo.(Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações).

PROCEDIMENTOS:

  • Após a extração do DNA, adiciona-se uma mistura (conhecida como pré-mix) que contém:

    • dNTPs
    • Primers (ou iniciadores)
    • Solução Tampão.
    • Enzima Taq DNA polimerase

Taq DNA polimerase

  • A Taq DNA polimerase, também denominada Taq polimerase ou apenas Taq, é uma DNA polimerase termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA através da técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus, encontrada em fontes hidrotermais. A Taq polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 94ºC).

PROCEDIMENTOS

  • Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).

TERMOCICLADOR

PROCEDIMENTOS

  • O Ciclo da PCR, no termociclador, ocorre em três fases:

    • Fase de Desnaturação (94-96ºC)
    • Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC)
    • Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)

Fase de Desnaturação

  • a temperatura é elevada de 94 a 96ºC por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação) através da quebra das pontes de hidrogênio, dando origem a duas fitas simples de DNA sobre as quais a síntese posteriormente vai ocorrer

Fase de hibridização ou anelamento

  • a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento).

Fase de Extensão do DNA

  • a temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima taq-polimerase possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado.

PROCEDIMENTOS

  • O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.

  • Duas cadeias são sintetizadas a partir de cada cadeia molde em cada ciclo completo de PCR, o que dá um crescimento EXPONENCIAL, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cópias do que no início.

RESULTADOS

RESULTADOS

  • O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.

VANTAGENS

  • Capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA.

  • Simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade.

  • Não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar, mesmo que se encontre misturado com o DNA de outras espécies, uma vez que os primers definirão a especificidade.

  • Técnica rápida, barata e segura.

LIMITAÇÕES

  • Necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para sintetizar primers específicos.

  • Relativa facilidade com que ocorre a contaminação por DNA estranho.

  • Limitada extensão da sequência.

  • Incorporação errônea de bases durante a replicação.

VARIAÇÕES DA TÉCNICA BÁSICA DE PCR

  • Nested PCR

  • Hot Start

  • Real time PCR

  • RAPD-PCR

  • Entre outras...

Nested PCR

  • Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e utilizando-se este primeiro produto, segue-se à amplificação da real sequência-alvo.

Hot Start

  • Variação da PCR onde a reação de amplificação é iniciada a temperaturas elevadas.

  • Atividade da Taq DNA polimerase é inibida durante a preparação da reação

  • evitando a amplificação de produtos inespecíficos,aumentando a especificidade e melhorando o rendimento da reação.

Real time PCR

  • PCR em tempo real compreende uma amplificação convencional de DNA, porém a detecção do resultado é feita a longo dos ciclos através de marcadores.

  • O risco de contaminação se torna menor.

RAPD-PCR

  • Consiste na amplificação randômica do DNA, por um par de iniciadores de baixa especificidade para com o DNA molde, gerando assim anelamentos inespecíficos.

  • Essa técnica permite a tipagem do genoma de microorganismos, possibilitando sua comparação entre isolados de amostras clínicas.

BIBLIOGRAFIA

  • http://virtual.unipar.br/courses/GMBM/document/aula-PCR-MESTRADO.pdf?cidReq=GMBM

  • http://www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htm

  • http://pt.wikipedia.org/wiki/PCR

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