Baixe Eficacia da doxiciclina e do dipropionato de imidocarb no tratamento da ehrlichia canis em caes e outras Teses (TCC) em PDF para Medicina Veterinária, somente na Docsity! UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL EFICÁCIA DA DOXICICLINA E DA COMBINAÇÃO COM O DIPROPIONATO DE IMIDOCARB NO TRATAMENTO DE Ehrlichia canis EM CÃES Efficacy of doxycycline and combination with imidocarb dipropionate in the treatment of Ehrlichia canis in dogs Thatianna Camillo Pedroso CAMPO GRANDE MATO GROSSO DO SUL-BRASIL DEZEMBRO-2006 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL EFICÁCIA DA DOXICICLINA E DA COMBINAÇÃO COM O DIPROPIONATO DE IMIDOCARB NO TRATAMENTO DE Ehrlichia canis EM CÃES Efficacy of doxycycline and combination with imidocarb dipropionate in the treatment of Ehrlichia canis in dogs Thatianna Camillo Pedroso Profa. Dra. Veronica Jorge Babo-Terra Dr. Flábio Ribeiro De Araújo Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, como requisito à obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Saúde Animal. CAMPO GRANDE MATO GROSSO DO SUL-BRASIL DEZEMBRO-2006 AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Carlos Henrique Rodrigues Pedroso e Berenice Camillo Pedroso, pelo amor, zelo e presença constantes. Aos meus avós, Frederico Pedroso e Dirce Rodrigues Pedroso, pela paciência e incentivo. Ao Alexandre Pereira, companheiro de muitas vidas, pelo apoio e compreensão. À minha orientadora Profa. Dra. Veronica Jorge Babo-Terra, pelo apoio, confiança, disponibilidade e especialmente a amizade desenvolvida ao longo do curso. Ao meu co-orientador Dr. Flábio Ribeiro de Araújo, pela atenção, ensinamentos e abertura das portas da Embrapa Gado de Corte para pesquisas com Ehrlichia canis. À Médica Veterinária Daniela Torres Cantadori, pelo apoio ao projeto e amizade. À Médica Veterinária Michelle Carmo de Almeida, pela prestatividade e auxílio no desenvolvimento da técnica de PCR. Ao Centro de Controle de Zoonoses e seus funcionários, pela atenção dedicada e disponibilidade dos animais. Aos funcionários Sandro Pinto de Araújo, Celso de Barros Calças, Sérgio Ferreira, Reginaldo Ferreira e Alfredo José de Sousa pelo auxílio técnico. Aos acadêmicos de Medicina Veterinária Andréia Santana Silveira, Walderson Zuza Barbosa, Daniel da Costa Feliz, Lenice Mie Joboji e Marcus Vinicius Lima Furtado pela ajuda nas coletas, exames físicos e medicação dos animais. À Marilete Otaño Peixoto Ferencz, pela simpatia e prontidão. Aos amigos, nem sempre tangíveis, mas sempre presentes, pela compreensão e motivação. À CAPES, pela bolsa de Mestrado. Ao Laboratório Ouro Fino, pelas medicações cedidas. À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia e à Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, pela formação e disponibilização de oportunidades. Aos animais Kika, Lili, Bóris, Nina, Duquesa, Dolly, Apolo, Pandora, Pity, Ploc, Sapeca, Princesa, Florzinha, Pelé e Poti, por se manterem carinhosos e amáveis mesmo quando seus corpos foram emprestados à ciência. Sirvo-me dos animais para instruir os homens. (La Fontaine) LISTA DE TABELAS TABELA 1. Freqüência absoluta e relativa das principais manifestações clínicas observadas antes e depois de cada tratamento em cães naturalmente infectados por Ehrlichia canis............................................................................................................50 TABELA 2. Freqüência absoluta e relativa das principais alterações hematológicas observadas antes e depois de cada tratamento em cães naturalmente infectados por Ehrlichia canis............................................................................................................50 LISTA DE ABREVIATURAS AAG – Alfa-1-ácido-glicoproteínas ALT – Alanina aminotransferase CCZ – Centro de Controle De Zoonoses CRP – Proteínas C-reativas DNA – Ácido desoxirribonucléico E. canis – Ehrlichia canis E. chaffeensis – Ehrlichia chaffeensis EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético ELISA – Imunoensaio de ligação enzimática FAMEZ – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FAS – Fosfatase alcalina Grupo C – Grupo controle, sem tratamento Grupo D – Grupo tratado apenas com doxiciclina Grupo I – Grupo tratado com associação de doxiciclina e dipropionato de imidocarb IFI – Imunofluorescência indireta IM – Via intramuscular PCR – Reação em Cadeia de Polimerase R. sanguineus – Rhipicephalus sanguineus RNA – Ácido ribonucléico SC – Via subcutânea UV – Ultravioleta VO – Via oral WI – Western Immunoblotting RESUMO Os objetivos deste trabalho foram comparar a eficácia do tratamento isolado com doxiciclina e da combinação do dipropionato de imidocarb com doxiciclina em cães naturalmente infectados por E. canis, verificando se há vantagens ou não no tratamento combinado; certificar a necessidade de tratamento em cães assintomáticos e ainda acompanhar a evolução clínico-hematológica dos animais durante os tratamentos isolado e combinado. Quinze cães diagnosticados para E. canis por meio de observação de mórulas em células de esfregaço sanguíneo foram distribuídos em três grupos, sem tratamento (C), tratamento com doxiciclina 10 mg/kg via oral uma vez ao dia por 28 dias (D) e doxiciclina combinada ao dipropionato de imidocarb (I), em duas injeções de 5 mg/kg subcutânea com intervalo de 14 dias. Foram realizados exames físico e hematológico semanalmente. A nested PCR para E. canis foi realizada antes e após o tratamento. Verificou-se que os tratamentos foram eficientes, resolveram os sinais clínicos em poucos dias e promoveram a recuperação hematológica em cerca de 70% dos cães. No entanto, não foi observada diferença entre os tratamentos. A eliminação de E. canis foi observada por nested PCR de sangue total em 70% dos cães tratados. Palavras-chave: Doxiciclina - Dipropionato de imidocarb - Ehrlichia canis - PCR - Cães. Além de vetor, R. sanguineus é considerado reservatório primário de E. canis (EWING, 1969; GROVES et al., 1975) por ser capaz de transmitir a bactéria por cerca de 155 dias em qualquer estágio de desenvolvimento (GREENE & HARVEY, 1990). O contágio ocorre com a ingestão de leucócitos infectados principalmente durante a fase aguda da doença no cão. Entre os carrapatos ocorre a transmissão transestadial, porém não ocorre a transmissão transovariana (GROVES et al., 1975). Do carrapato para o cão, a infecção ocorre durante o repasto sanguíneo; no entanto, os cães também podem se infectar por meio de transfusão sanguínea (EWING, 1969; REINE, 2004). Algumas observações sugeriram infecção também em humanos, no entanto hoje se sabe que as infecções em humanos são causadas por E. chaffeensis, que também tem tropismo por células mononucleares e é geneticamente muito semelhante a E. canis, por isso apresenta mórulas semelhantes e reação cruzada de anticorpos (DAWSON et al., 1991). Os principais animais acometidos por E. canis são os membros da família Canidae, que inclui cães, lobos e chacais (RIKIHISA, 2006). 1.2 PATOGÊNESE Com infecções experimentais foi possível observar que o período de incubação da erlichiose varia de oito a vinte dias e podem ser distintas três fases da doença: aguda, subclínica e crônica (GREENE & HARVEY, 1990; HARRUS et al., 1997). Durante a fase aguda, a bactéria invade as células mononucleares teciduais, multiplica-se e produz hiperplasia linforreticular no baço, fígado e linfonodos. As células infectadas são transportadas pela corrente sanguínea para pulmões, rins e meninges, aderindo-se ao endotélio vascular e produzindo vasculite e infecção do tecido subendotelial (GREENE & HARVEY, 1990; HARRUS et al., 1997). Também invade células mononucleares circulantes formando corpúsculos iniciais, corpos elementares e então mórulas (EWING, 1969; KUEHN & GAUNT, 1985; ELIAS, 1991). Na fase subclínica, geralmente surge a hiperglobulinemia, nem sempre relacionada à eliminação de E. canis (GREENE & HARVEY, 1990). Testes de imunização em cães utilizando soro antilinfócitos conseguiram desencadear uma alta produção de anticorpos, mas não houve mudanças no curso da enfermidade. Os resultados dos testes indicaram que a resposta humoral parece eficiente apenas na eliminação de espécies extracelulares de Ehrlichia, enquanto a destruição das intracelulares depende da resposta imune celular (NYNDO et al., 1980). Assim, cães imunocompetentes podem eliminar a bactéria e não entrar na fase crônica, enquanto aqueles sem resposta imune efetiva permanecem doentes e podem apresentar processos imunomediados (GREENE & HARVEY, 1990). Alguns cães podem se manter infectados por longos períodos, inclusive por anos (HARRUS et al., 1998a). A fase crônica é caracterizada pela pancitopenia decorrente do comprometimento da medula óssea, que pode ser causado por mecanismos imunomediados, infecção no interior da medula óssea ou exaustão devido à destruição contínua de plaquetas (GREENE & HARVEY, 1990). A recente caracterização molecular de E. canis identificou uma deficiência de componentes estruturais, tais como peptideoglicanos e lipopolissacarídeos. A falta desses componentes resultou no desenvolvimento de uma complexa estrutura de proteínas de membrana. Essas proteínas têm papel potencial nas estratégias adaptativas de evasão imune do microrganismo e nas interações entre o patógeno e a célula hospedeira. Foi identificado um set de proteínas imunorreativas que inclui glicoproteínas importantes para a resposta imune e uma família de proteínas de membrana. Em outras espécies de Ehrlichia essa família de proteínas possui 22 genes parálogos, enquanto em E. canis são 25 genes parálogos que podem se expressar diferentemente no carrapato e nos hospedeiros mamíferos, facilitando a diversidade antigênica e a imunoproteção, contribuindo para as infecções persistentes (MAVROMATIS et al., 2006). Anteriormente, já havia sido cogitada a possibilidade de que o baço hospedasse E. canis e que ela se escondesse em macrófagos esplênicos escapando da resposta imune (HARRUS et al., 1998a). 1.3 ASPECTOS CLÍNICOS Diversos sinais clínicos são associados à erlichiose monocítica canina. Estes sinais são influenciados pela cepa infectante, imunidade individual, idade e raça do cão, re-exposição ao agente, presença de co-infecções e provavelmente também a fatores ainda desconhecidos (KUEHN & GAUNT, 1985; GREENE & HARVEY, 1990; BREITSCHWERDT et al., 1998a; COHN, 2003). Cães da raça Pastor Alemão são considerados mais suscetíveis (NYINDO et al., 1980; ELIAS, 1991). Na fase aguda os sinais clínicos são mais aparentes, porém geralmente são insuficientes ou pouco específicos para o diagnóstico. Os sinais clínicos desta fase incluem febre, depressão, anorexia, perda de peso, mucosas pálidas, secreção oculonasal, linfadenopatia e hepatoesplenomegalia (GREENE & HARVEY, 1990; HARRUS et al., 1997; COHN, 2003; CASTRO et al., 2004). ausência das mórulas não exclui a possibilidade de infecção (ELIAS, 1991; MUTANI & KAMINJOLO, 2001). Nos esfregaços realizados a partir da ponta de orelha pode ser mais fácil visualizar a mórula do que no esfregaço sanguíneo convencional (EWING, 1969; ELIAS, 1991). Além da observação da mórula em esfregaço sanguíneo, é possível diagnosticar a erlichiose por outros métodos. Dentre os métodos indiretos está a Imunofluorescência Indireta (IFI), método sorológico que utiliza anticorpos fluorescentes. A IFI é bastante sensível e específica, mas tem a desvantagem de apresentar resultados falso-negativos ou falso-positivos e a impossibilidade de identificação da fase da doença. Na verdade, a presença de títulos de anticorpos apenas significa contato prévio com o agente (IQBAL & RIKIHISA, 1994b). Outros testes sorológicos incluem o Western Immunoblotting (WI) e o teste de ELISA. O WI mostrou-se mais sensível que a IFI e seus resultados são objetivos, isto é, não sofrem interferência da sensibilidade visual do leitor, porém é mais demorado, dispendioso e necessita de tecnologia mais avançada (IQBAL et al., 1994). O teste de ELISA é tão sensível e específico quanto a IFI e dispensa equipamentos caros. No entanto, apesar da fácil leitura, seus resultados indicam apenas positivo ou negativo (LABARTHE et al., 2003). O problema em comum dos testes sorológicos é que eles não possibilitam diferenciar a manutenção da resposta imune de uma re-exposição ao agente; além disso, são observadas reações cruzadas com outras espécies de Ehrlichia (BARTSCH & GREENE, 1996; WEN et al., 1997; MUTANI & KAMINJOLO, 2001). Entre os métodos de diagnóstico direto, incluem-se a cultura celular in vitro e a reação em cadeia de polimerase (PCR). Na cultura celular tradicional, os leucócitos do indivíduo são isolados e mantidos em meio próprio com linhagem celular específica, onde Ehrlichia se prolifera (IQBAL & RIKIHISA, 1994a). Técnicas recentes de cultivo celular utilizam apenas soro estéril e dispensam as linhagens celulares específicas para o crescimento. Em ambas, é possível localizar as mórulas com maior facilidade, devido a sua maior quantidade, em comparação ao esfregaço sanguíneo convencional (MUTANI & KAMINJOLO, 2001). A cultura celular in vitro é considerada o método mais sensível para o diagnóstico da erlichiose, pois detecta a bactéria a partir do segundo dia de infecção (IQBAL et al., 1994; MUTANI & KAMINJOLO, 2001). Contudo, ainda se trata de um método relativamente demorado, caro, exigente e que isolado não revela a espécie de Ehrlichia (WEN et al., 1997; MUTANI & KAMINJOLO, 2001). Devido a essas desvantagens fez-se necessário buscar um método diagnóstico sensível, específico, menos complicado e que também detecte diretamente a bactéria. Dessa necessidade surgiram as primeiras PCR para detecção de E. canis (IQBAL et al., 1994; IQBAL & RIKIHISA, 1994a). Na PCR, realiza-se o isolamento genômico e a amplificação de porção do DNA do patógeno que permite seu reconhecimento específico; para isso são utilizados fragmentos seqüenciais de DNA, chamados primers. Na nested PCR ou PCR de dois ciclos, um par de primers reconhece o gênero Ehrlichia a partir da amplificação de uma porção da seqüência gênica do 16S RNA ribossomal e outro par diferencia a espécie, amplificando um segmento interno específico localizado dentro da primeira porção amplificada. Por isso, também é considerado um método muito sensível e específico (IQBAL & RIKIHISA, 1994a; WEN et al., 1997). A PCR pode ser aplicada tanto em amostras de sangue como de tecidos (IQBAL & RIKIHISA, 1994a; HARRUS et al., 1998a). O prognóstico na fase aguda é geralmente favorável, pois com a antibioticoterapia ocorre melhora clínica em cerca de um a dois dias. Na fase subclínica, o prognóstico vai de favorável a reservado conforme a sintomatologia do animal e sua predisposição individual de entrar ou não na fase crônica. Nesta última, o prognóstico é desfavorável, principalmente quando se instalou hipoplasia arregenerativa na medula óssea (GREENE & HARVEY, 1990; HARRUS et al., 1997). 1.6 TERAPÊUTICA Os derivados da tetraciclina são considerados o tratamento de eleição para erlichiose há muitos anos (HUXSOLL et al., 1970). Atualmente, o consenso sugere o uso da doxiciclina na dosagem de 10 mg/kg VO uma vez ao dia durante 28 dias (NEER et al., 2002). A doxiciclina é uma tetraciclina lipossolúvel bastante eficiente, pois os animais geralmente apresentam melhora clínica dentro de três dias (SAINZ, 1996). Ela também é a droga de eleição no caso de filhotes ou animais com nefropatia (COHN, 2003). O tratamento com dipropionato de imidocarb também se mostrou efetivo na eliminação de E. canis (PRICE & DOLAN, 1980; MATTHEWMAN et al., 1994). No entanto, estudos mais recentes não observaram diferenças na resposta clínica quando comparado à doxiciclina, associado a esta droga (SAINZ, 1996; SOUSA et al., 2004) ou utilizado isoladamente (SAINZ, 1996; EDDLESTONE et al., 2006). A dose recomendada do dipropionato de imidocarb é de 5 mg/kg SC ou IM com intervalo de 14 dias. O pré-tratamento com atropina, 0,04 mg/kg, é recomendado a fim de minimizar os efeitos adversos da droga (MATTHEWMAN et al., 1994; NEER et al., 2002). é até cem vezes mais sensível que os primeiros primers delineados para PCR de E. canis e por isso tem sido amplamente empregada em experimentos que desejam avaliar a eficiência da antibioticoterapia (WEN et al., 1997; HARRUS et al., 1998b). Apesar de a validade da PCR ser questionada por ela detectar o DNA de E. canis e não diferenciar os organismos vivos dos mortos (COHN, 2003), seus resultados, quando comparados aos de cultivo celular a partir de amostras de sangue e tecidos pós-tratamento com doxiciclina foram concordantes, o que demonstrou a efetividade e sensibilidade do método para avaliação da eliminação terapêutica (IQBAL & RIKIHISA, 1994a). 1.8 PROFILAXIA A profilaxia deve ser focada no controle efetivo dos carrapatos. Quando animais de áreas endêmicas forem transportados para áreas livres, estes devem ser testados e se necessário tratados anteriormente (HUXSOLL et al., 1970). Cães doadores de sangue deverão passar por triagem com testes sorológicos ou moleculares (REINE, 2004). Também pode ser feita a quimioprevenção com tetraciclina, na dose de 6,6 mg/kg uma vez ao dia, durante o período de uma geração de carrapatos ou até dois anos em áreas endêmicas (GREENE & HARVEY, 1990), ou ainda 100 mg de doxiciclina uma vez ao dia (DAVOUST et al., 2005). Desde a sua identificação, há cerca de 70 anos, a erlichiose tornou-se uma das doenças infecciosas de importância mundial na clínica veterinária de pequenos animais devido a sua alta prevalência e morbidade. A utilização da doxiciclina no tratamento da erlichiose é consensual tanto entre pesquisadores quanto entre práticos, e sua associação ao dipropionato de imidocarb tem sido amplamente empregada apesar dos resultados conflitantes encontrados na literatura. Este trabalho tem o intuito de verificar e esclarecer se há vantagens em associar o dipropionato de imidocarb à doxiciclina no tratamento de cães naturalmente infectados pela E. canis do ponto de vista clínico, hematológico e da eliminação terapêutica. REFERÊNCIAS BARTSCH, R. C., GREENE, R. T. Post-therapy antibody titers in dogs with ehrlichiosis: follow-up study on 68 patients treated primarily with tetracycline and/or doxycycline. J Vet Intern Med, v.10, n.4, p.271-274, 1996. BREITSCHWERDT, E. B., HEGARTY, B. C., HANCOCK, S. I. Doxycycline hyclate treatment of experimental canine ehrlichiosis followed by challenge inoculation with two Ehrlichia canis strains. Antimicrobial Agents Chemother, v.42, n.2, p.362-368, 1998. BULLA, C, TAKAHIRA, R. K., ARAUJO JR., J. P., TRINCA, L. A., LOPES, R. S., WIEDMEYER, C. E. The relationship between degree of thrombocytopenia and infection with Ehrlichia canis in an endemic area. Vet Res, n.35, p.141-146, 2004. CASTRO, M. B., MACHADO, R. Z., AQUINO, L. P. C. T., ALESSI, A. C., COSTA, M. T. Experimental acute canine monocytic ehrlichiosis: clinicopathological and immunological findings. Vet Parasitol, n.119, p.73-86, 2004. COHN, L. A. Ehrlichiosis and related infections. 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Western Immnunoblot analysis of Ehrlichia chaffeensis, E. canis, or E. ewingii infections in dogs and humans. J Clin Microbiol, v.32, n.9, p.2107-2112, 1994. RIKIHISA, Y. New taxonomy of the family Anaplasmataceae and philogram of the family Anaplasmataceae. http://riki-lb1.vet.ohioo-state.edu/ehrlichia/background.php. On-line, acesso em 07/09/2006. SAINZ, A. Aspectos clinicos y epizootiologicos de la ehrlichiosis canina. Estudio comparado de la eficacia terapeutica de la doxiciclina y el dipropionato de imidocarb. Universidad Complutense de Madrid. Tese de Doutorado. 255p. Madrid, 1996. SMITH, R. D., RISTIC, M., HUXSOLL, D. L., BAYLOR, R. A. Platelet kinetics in canine ehrlichiosis: evidence for increased platelet destruction as the cause of thrombocytopenia. Infect Immun, v.11, n.6, p.1216-1221, 1975. SOUSA, M. G., HIGA, A. C., GERARDI, D. G., TINUCCI-COSTA, M., MACHADO, R. 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J Clin Microbiol, v.35, n.7, p.1852-1855, 1997. 3 ARTIGO Eficácia da doxiciclina e da combinação com o dipropionato de imidocarb no tratamento de Ehrlichia canis em cães Efficacy of doxycycline and combination with imidocarb dipropionate in the treatment of Ehrlichia canis in dogs Thatianna Camillo PEDROSO1, Flábio Ribeiro de ARAÚJO2, Veronica Jorge BABO-TERRA3 RESUMO Os objetivos deste trabalho foram comparar a eficácia do tratamento isolado com doxiciclina e da combinação do dipropionato de imidocarb com doxiciclina em cães naturalmente infectados por E. canis, verificando se há vantagens ou não no tratamento combinado; certificar a necessidade de tratamento em cães assintomáticos e ainda acompanhar a evolução clínico-hematológica dos animais durante os tratamentos isolado e combinado. Quinze cães diagnosticados para E. canis por meio de observação de mórulas em células de esfregaço sanguíneo foram distribuídos em três grupos, sem tratamento (C), tratamento com doxiciclina 10 mg/kg via oral uma vez ao dia por 28 dias (D) e doxiciclina combinada ao dipropionato de imidocarb (I), em duas injeções de 5 mg/kg subcutânea com intervalo de 14 dias. Foram realizados exames físico e hematológico semanalmente. A nested PCR para E. canis foi realizada antes e após o tratamento. Verificou-se que os tratamentos foram eficientes, resolveram os sinais clínicos em poucos dias e promoveram a recuperação hematológica em cerca de 70% dos cães. No entanto, 1 Médica Veterinária, Mestranda do Programa de Pós Graduação em Ciência Animal, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Rua das Garças, n. 1666, apartamento 22, bloco B16, CEP 79020-180, Campo Grande, MS. E-mail: thatyvet@yahoo.com.br. Autor para correspondência. 2 Médico Veterinário, Pesquisador Doutor, Embrapa Gado de Corte. 3 Médica Veterinária, Professora Adjunto 1 Doutora, Departamento de Medicina Veterinária UFMS. 1997a). Freqüentemente são observadas co-infecções, especialmente com outros patógenos transmitidos por artrópodes, tais como Babesia canis, Hepatozoon canis, Anaplasma platys e Mycoplasma haemocanis (Ewing 1969, Kuehn & Gaunt 1985, Moreira et al. 2003). A pancitopenia é o achado mais característico da fase crônica (Harrus et al. 1997a, Cohn 2003). A observação das mórulas confirma a presença de E. canis, podendo ser vista em monócitos, linfócitos (Ewing 1969, Kuehn & Gaunt 1985, Elias 1991) e neutrófilos (Ewing 1969, Huxsoll et al. 1970). Além da observação da mórula em esfregaço sanguíneo é possível diagnosticar a erlichiose por métodos sorológicos, cultivo celular e pela Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). A PCR é um método muito sensível e específico, que pode ser aplicado em amostras de sangue e tecidos (Iqbal & Rikihisa 1994a, Wen et al. 1997, Harrus et al. 1998a, Harrus et al. 2004). Para o tratamento, o consenso atual sugere o uso da doxiciclina na dosagem de 10 mg/kg via oral (VO) uma vez ao dia durante 28 dias (Sainz 1996, Neer et al. 2002). O tratamento com dipropionato de imidocarb ainda é controverso, sendo recomendado por alguns autores, em duas doses de 5 mg/kg por via intramuscular (IM) ou subcutânea (SC) com intervalo de 14 dias (Price & Dolan 1980, Matthewman et al. 1994, Sainz 1996) e não recomendado por outros (Sousa et al. 2004, Eddlestone et al. 2006). Os objetivos deste trabalho foram comparar a eficácia do tratamento isolado com doxiciclina e da combinação do dipropionato de imidocarb com doxiciclina em cães naturalmente infectados por E. canis; verificar se há vantagens ou não no tratamento combinado; certificar a necessidade de tratamento em cães assintomáticos e ainda acompanhar a evolução clínico-hematológica dos animais durante os tratamentos isolado e combinado. MATERIAIS E MÉTODOS No período de novembro de 2005 a junho de 2006, cães provenientes do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ), Campo Grande/MS, foram diagnosticados para erlichiose monocítica canina pela observação de mórulas em monócitos ou linfócitos de esfregaços sanguíneos. Foram realizados esfregaços pareados de ponta de orelha, sendo um corado pelo método de May-Grünwald-Giemsa e outro com Panótico. Em cada lâmina, examinou-se a extensão das duas margens do esfregaço bem como pelo menos dez campos na franja. Não houve restrição quanto ao sexo, raça, idade ou peso do animal. Animais com infecção concomitante por outros hemoparasitos, como Babesia canis, Hepatozoon canis, Anaplasma platys e Leishmania sp., foram excluídos. Quinze animais foram aleatoriamente distribuídos em três grupos: controle (C, n=5), tratamento com doxiciclina (D, n=5) e tratamento combinado de doxiciclina e dipropionato de imidocarb (I, n=5). Todos os animais receberam água e ração comercial seca à vontade e foram submetidos a controle de ectoparasitos com Frontline® top spot (fipronil, Merial Saúde Animal) e endoparasitos com Endal Plus® (pamoato de pirantel, febantel e praziquantel, Schering-Plough Coopers). Os animais dos grupos de tratamento receberam Doxifin® comprimidos (doxiciclina, Ouro Fino), 10 mg/kg VO a cada 24 horas durante 28 dias e Imizol® (dipropionato de imidocarb, Schering-Plough Coopers), duas injeções de 5mg/kg SC com intervalo de 14 dias. Nenhum outro antibiótico ou tratamento de suporte foi administrado. A respeito desses animais, foram registrados dados sobre identificação, informações epidemiológicas, manifestações clínicas e o quadro hematológico. Os animais foram reavaliados a cada sete dias após o início do tratamento, considerado dia zero. Nas reavaliações, realizou-se novo exame físico e uma amostra de sangue com EDTA foi coletada para realização de hemograma, num total de cinco coletas. Amostras de sangue foram obtidas para plaquetometria no dia 0, aos 14 dias e no último dia de tratamento, conforme o grupo. Para a nested PCR, foram coletadas duas amostras de sangue com EDTA, uma antes do tratamento para confirmação da presença de E. canis, outra após o tratamento, a fim de demonstrar a eliminação terapêutica do microorganismo. No caso de tratamento somente com doxiciclina, a segunda amostra foi obtida dois dias após o término do tratamento e no caso de combinação com o dipropionato de imidocarb, esta foi obtida trinta dias após a última injeção. Estes intervalos foram determinados com o objetivo de diminuir a interferência do efeito residual de cada droga, aproximadamente 19,5 horas para doxiciclina (Iqbal & Rikihisa 1994b) e 30 dias para o dipropionato de imidocarb (Price & Dolan 1980). Para extração do DNA foram utilizados 350 µl de sangue e o kit Easy-DNATM (Invitrogen Corporation), seguindo as orientações do fabricante. Na última etapa da extração, o DNA foi ressuspendido em 100 µl de H2O ultrapura. A concentração do DNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 0,8% com o marcador lâmbda (λ) 50 (Invitrogen Corporation). Para amplificação de um fragmento do gene 16S rRNA de E.canis foi seguida a metodologia de Wen et al. (1997) com algumas alterações. Foram utilizados 2 µl de DNA em reações de 25 µl, contendo 2,5 µl de tampão 10x, 0,8 µl de 1,5 mM de MgCl2, 0,5 µl de 0,25 mM de trifosfato deoxinucleotídeos, 2,5 U de Taq polimerase, 100 ng do primer ECC (5´- apresentavam trombocitopenia na primeira avaliação, mas no final do período, apenas o animal C-04 não se encontrava trombocitopênico. Nos quinze cães, foi freqüente a observação de macroplaquetas por todo o período de avaliação. Dois animais do grupo D iniciaram o tratamento com leucopenia. Um normalizou a partir do dia 7 e outro somente no dia 30. Não foi observada leucocitose inicial em nenhum cão, porém os cães D-02 e D-04 apresentaram aumento da leucometria no decorrer do tratamento, regularizando os valores de leucócitos totais na última avaliação. No grupo I, a leucocitose não foi observada em nenhum momento. A leucopenia esteve presente em dois animais no dia 0 (I-03 e I- 05), o cão I-05 apresentou valores normais a partir do dia 7, já o cão I-03 não se recuperou dentro do período de avaliação. No grupo C, apenas o cão C-02 apresentou leucocitose inicial, entrando na faixa de normalidade a partir do dia 14; o oposto aconteceu com o cão C-05. Nenhum animal deste grupo apresentou leucopenia. Entre as alterações de contagem diferencial de leucócitos, monocitose e linfopenia foram as mais freqüentes (Tab. 2). Monocitose foi observada inicialmente em apenas um animal do grupo D (D-03), que apresentou valores normais a partir do dia 21. Os cães D-02 e D-05 apresentaram monocitose nas avaliações intermediárias, mas chegaram ao final do tratamento exibindo valores normais. No grupo I, também se observou monocitose inicial em apenas um cão (I-01), que normalizou a partir do dia 14. No grupo C, quatro cães apresentaram monocitose inicial. No final do período, dois cães mantiveram a monocitose, dois apresentaram valores normais (150 -1.350 monócitos), mas próximos do limite superior, e aquele que não tinha monocitose inicial, finalmente apresentou aumento do número de monócitos. Foi observada linfopenia inicial em três animais do grupo D. Todos se recuperaram, mas o tempo variou individualmente, sendo o cão D-01 no dia 7, D-04 no dia 30 e D-05 no dia 14. No grupo I, apenas o cão I-05 apresentava linfopenia inicial e não se recuperou dentro do período de avaliação. O animal I-03, o mesmo que não se recuperou da leucopenia, começou a apresentar linfopenia a partir do dia 14 e a manteve até a última observação. Todos os cães do grupo C apresentaram contagem normal de linfócitos (1.000 a 4.800 linfócitos) inicialmente, mas ao final do tratamento, os cães C-02 e C-05 apresentavam linfopenia. A presença de monócitos ativados e linfócitos reacionais foi freqüente nos três grupos (Fig. 1). Essas alterações persistiram nos animais do grupo C e se resolveram nos animais tratados, com exceção do animal D-05 que chegou ao final do tratamento apresentando inclusive mórulas de E. canis. Todos os animais apresentavam mórula no início do período. Em catorze animais, a mórula foi observada em monócitos e apenas um em linfócitos; não foram observadas mórulas em outros leucócitos ou em plaquetas. Ao final do período, apenas os cães D-05, C-02 e C-03 ainda apresentavam mórulas. Na nested PCR pré-tratamento, os quinze cães foram positivos (Fig. 2, 3 e 4). No pós-tratamento, dois cães do grupo D (D-04 e D-05) foram positivos (Fig. 2), ou seja, 60% dos cães tornaram-se negativos na nested PCR após o tratamento. No grupo I, apenas o cão I-01 apresentou resultado positivo na amostra de sangue pós- tratamento (Fig. 3), isto é, 80% tornaram-se negativos. No grupo C, os cinco cães mantiveram as reações positivas (Fig. 4). A eliminação terapêutica foi considerada eficaz quando o cão apresentou resultado negativo na nested PCR de sangue pós-tratamento. Houve associação estatística entre as freqüências de eliminação terapêutica nos grupos de tratamento quando comparadas ao grupo C (P=0,018). Entre os grupos de tratamento, D e I, não foi encontrada diferença estatística (P=0,41). DISCUSSÃO Os sinais clínicos observados nos cães dos três grupos foram semelhantes aos descritos na literatura para erlichiose monocítica canina (Kuehn & Gaunt 1985, Harrus et al. 1997b, Moreira et al. 2003). A presença de carrapatos observada no dia 0 (Harrus et al. 1997a), o diagnóstico realizado pela observação de mórulas (Elias 1991) e os sinais clínicos observados (Greene & Harvey 1990, Harrus et al. 1997a) sugerem que os animais estavam na fase aguda da erlichiose. O tempo de resposta clínica à terapia sofre interferência da fase da doença (Buhles et al. 1974, Harrus et al. 1998b), sendo mais rápida na fase aguda e mais demorada na fase crônica. Supondo que os animais estudados encontravam-se na fase aguda, a resposta ao tratamento ocorreu conforme esperado (Buhles et al. 1974, Greene & Harvey 1990), dentro de sete dias, intervalo existente entre a primeira e segunda avaliação. Animais sem tratamento geralmente passam pela fase aguda e adentram a fase subclínica como clinicamente saudáveis (Greene & Harvey 1990, Harrus et al. 1997a), podendo se manter assim por longos períodos (Harrus et al. 1998a). Esse poderia ser o caso do animal C-04. Cães clinicamente sadios que permanecem infectados podem servir de hospedeiros, ser inadvertidamente utilizados como doadores de sangue ou mesmo vir a manifestar sintomas apenas na fase crônica, quando o tratamento é geralmente mais complicado e o prognóstico desfavorável (Harrus et al. 1998a). Harvey 1990, Moreira et al. 2003) e em desacordo com Elias (1991), que cita os linfócitos como as células mais infectadas. O animal D-05 ainda apresentava mórulas na última avaliação, por isso era esperado que tivesse um resultado positivo na nested PCR pós-tratamento. Devido ao controle de ectoparasitos, foi descartada a hipótese deste cão ter sido re- infectado durante o período de avaliação. É possível que este cão não estivesse na fase aguda como inicialmente supôs-se e sua resposta ao tratamento fosse mais demorada, pois animais na fase aguda geralmente se recuperam mais rapidamente que aqueles na fase crônica (Cohn 2003). Neste estudo, empregou-se a nested PCR em amostras de sangue obtidas antes e após o tratamento devido à aplicabilidade deste método de coleta e sua praticidade na rotina da clínica veterinária de pequenos animais em relação à coleta de amostras do baço. Alguns autores sugerem que a melhor opção de amostra para PCR pós-tratamento, a fim de avaliar a eliminação da bactéria, seria do baço porque este órgão alberga Ehrlichia por mais tempo. Contudo, os próprios autores afirmam que a alta sensibilidade da PCR torna as duas formas de amostragem semelhantes (Harrus et al. 2004). Neste trabalho, o tratamento isolado com doxiciclina, administrada na dosagem do consenso atual de 10 mg/kg VO uma vez ao dia durante 28 dias (Neer et al. 2002), tornou 3 dos 5 cães do grupo D negativos na nested PCR pós- tratamento. Estudos prévios contradizem-se quanto à capacidade da doxiciclina em eliminar E. canis. Utilizando esta mesma dosagem por 7 dias apenas, a doxiciclina foi considerada ineficiente (Iqbal & Rikihisa 1994b). No entanto, quando o período de tratamento foi dobrado, a droga mostrou-se eficiente (Breitschwerdt et al. 1998). Pesquisas posteriores apontaram que o tratamento na fase aguda poderia ser reduzido para 16 dias (Harrus et al. 2004). Contudo, dificilmente identifica-se em que fase um cão naturalmente infectado se encontra (Moreira et al. 2003). No grupo I, que recebeu doxiciclina e dipropionato de imidocarb, em duas injeções de 5 mg/kg SC com intervalo de 14 dias, 4 dos 5 cães tornaram-se negativos na nested PCR. Estudos prévios com o dipropionato de imidocarb julgaram-no eficiente no tratamento da erlichiose (Price & Dolan 1980, Matthewman et al. 1994). Posteriormente, verificou-se que não havia diferenças entre o tratamento isolado com doxiciclina ou associado ao dipropionato de imidocarb (Sainz 1996, Sousa et al. 2004). Todavia, esses estudos não utilizaram métodos moleculares para avaliação da eliminação terapêutica. Em uma pesquisa recente, utilizando a PCR, constatou-se que o dipropionato de imidocarb não é capaz de eliminar E. canis (Eddlestone et al. 2006). Isso permite sugerir que os cães do presente estudo que receberam tratamento combinado de doxiciclina e imidocarb, provavelmente eliminaram a infecção devido à ação da doxiciclina apenas. Ao se comparar os resultados da nested PCR pós-tratamento obtidos nos grupos D e I não foi encontrada diferença significativa, assim como aconteceu quando se compararam parâmetros clínicos e hematológicos em outros trabalhos (Sainz 1996, Sousa et al. 2004). Assim, a combinação da doxiciclina ao dipropionato de imidocarb não demonstrou vantagens no tratamento da erlichiose nos cães deste estudo. Sugere-se que sua utilização seja restrita aos casos de infecção concomitante por Babesia canis devido à sua toxicidade e a freqüência com que são observadas reações adversas, como dor ou edema local, claudicação, salivação profusa, descarga ocular serosa, diarréia e depressão (Price & Dolan 1980). A dor no local de administração do dipropionato de imidocarb foi freqüente entre os cães do grupo I, porém raros efeitos colaterais foram observados. Apenas o animal I-05 apresentou salivação excessiva após as injeções. Além da dor local, os efeitos colinérgicos, tais como salivação excessiva, secreção ocular, diarréia e depressão são comuns após a utilização desta droga (Price & Dolan 1980), por isso recomenda-se que o animal seja observado por cerca de dez a quinze minutos após a injeção ou que se controle tais sinais com a administração prévia de sulfato de atropina na dose de 0,04 mg/kg (Matthewman et al. 1994, Neer et al. 2002). Apesar de não terem sido apontadas diferenças entre os tratamentos dos grupos D e I, as diferenças entre tratar e não tratar foram notáveis, pois todos os cães sem tratamento permaneceram positivos, inclusive o cão C-04, que se manteve aparentemente sadio e sem alterações hematológicas. Sempre que diagnosticados para E. canis, os cães devem ser tratados, pois se evita agravamentos, o estado de portador crônico (Iqbal & Rikihisa 1994b, Harrus et al. 1998a) e que sejam utilizados inadvertidamente como doadores de sangue (Reine 2004). Os resultados indicam que as drogas provavelmente foram eficientes na eliminação de E. canis do sangue de 70% dos cães. Contudo, os cães com resultados positivos pós-tratamento poderiam ainda apresentar o DNA da bactéria no sangue, porém esta se encontrar morta, já que é questionável a capacidade da PCR em diferenciar organismos vivos de mortos (Cohn 2003). Por outro lado, foi sugerido que pode haver parasitemia cíclica durante o período de recuperação do animal, o que exigiria avaliações repetidas com a PCR para garantir que se alcançou a eliminação terapêutica (Harrus et al. 1998b). Harrus S, Waner T, Aizenberg I, Bark H 1998b. Therapeutic effect of doxycycline in experimental subclinical canine monocytic ehrlichiosis: evaluation of a 6-week course. J Clin Microbiol 36: 2140-2142. Harrus S, Kenny M, Miara L, Aizenberg I, Waner T, Shaw S 2004. Comparison of simultaneous splenic sample PCR with blood sample PCR for diagnosis and treatment of experimental Ehrlichia canis infection. Antimicrobial Agents Chemother 48: 4488-4490. Huxsoll DL, Hildebrandt PK, Nims RM, Walker JS 1970. Tropical canine pancytopenia. J Am Vet Med Assoc 157: 1627-1632. Iqbal Z, Rikihiza Y 1994a. Application of the polymerase chain reaction for the detection of Ehrlichia canis in tissues of dogs. Vet Microbiol 42: 281-287. Iqbal Z, Rikihiza, Y 1994b. Reisolation of Ehrlichia canis from blood and tissues of dogs after doxycycline treatment. J Clin Microbiol 32: 1644-1649. Kuehn NF, Gaunt SD 1985. Clinical and hematologic findings in canine ehrlichiosis. J Am Vet Med Assoc 186: 355-358. Labarthe N, de Campos Pereira M, Barbarini O, McKee W, Coimbra CA, Hoskins J 2003. Serologic prevalence of Dirofilaria immitis, Ehrlichia canis, and Borrelia burgdorferi infections in Brazil. Vet Ther 4: 67-75. Matthewman LA, Kelly PJ, Brouqui P, Raoult D 1994. Further evidence for the efficacy of imidocarb dipropionate in the treatment of Ehrlichia canis infection. J S Afr Vet Assoc 65: 104-107. Moreira SM, Bastos CV, Araújo RB, Santos M, Passos LMF. Estudo retrospectivo (1998 a 2001) da erliquiose canina em Belo Horizonte. Arq Bras Med Vet Zootec 55: 141-147. Neer TM, Breitschwerdt EB, Greene RT, Lappin MR 2002. Consensus statement on ehrlichial disease of small animals from the infectious disease study group of the ACVIM. J Vet Intern Med 16: 309-315. Price JE, Dolan TT 1980. A comparison of the efficacy of imidocarb dipropionate and tetracycline hydrochloride in the treatment of canine ehrlichiosis. Vet Rec 107: 275-277. Reine NJ 2004. Infection and blood transfusion: a guide to donor screening. Clin Tech Small Anim Pract 19: 68-74. Sainz A 1996. Aspectos clínicos y epizootiológicos de la ehrlichiosis canina. Estudio comparado de la eficacia terapéutica de la doxiciclina y el dipropionato de imidocarb. Universidad Complutense de Madrid. Tese de Doutorado. Madrid, 255p. Smith RD, Ristic M, Huxsoll DL, Baylor RA 1975. Platelet kinetics in canine ehrlichiosis: evidence for increased platelet destruction as the cause of thrombocytopenia. Infect Immun 11: 1216-1221. Sousa MG, Higa AC, Gerardi DG, Tinucci-Costa M, Machado R 2004. Tratamento da erliquiose canina de ocorrência natural com doxiciclina, precedida ou não pelo dipropionato de imidocarb. Rev Cienc Agrovet 3: 126-130. Wen B, Rikihiza Y, Mott JM, Greene R, Kim HY, Zhi N, Couto GC, Unver A, Bartsch R 1997. Comparison of nested PCR with immunofluorescent-antibody assay for detection of Ehrlichia canis infection in dogs treated with doxycycline. J Clin Microbiol 35: 1852-1855. TABELAS TABELA 3. Freqüência absoluta e relativa das principais manifestações clínicas observadas antes e depois de cada tratamento em cães naturalmente infectados por Ehrlichia canis. Grupo D (n=5) Grupo I (n=5) Grupo C (n=5) Sinal clínico Antes Depois Antes Depois Antes Depois Febre (Tº > 39,5) 03 (60%) 00 02 (40%) 00 01 (20%) 01 (20%) Emagrecimento 04 (80%) 01 (20%) 01 (20%) 01 (20%) 02 (40%) 04 (80%) Anorexia 02 (40%) 01 (20%) 01 (20%) 01 (20%) 00 02 (40%) Apatia 03 (60%) 01 (20%) 01 (20%) 01 (20%) 00 00 Mucosas hipocoradas 02 (40%) 01 (20%) 04 (80%) 00 02 (40%) 04 (80%) Linfadenopatia 03 (60%) 01 (20%) 05 (100%) 01 (20%) 02 (40%) 03 (60%) Secreção ocular 02 (40%) 01 (20%) 02 (40%) 01 (20%) 01 (20%) 04 (80%) Tosse 01 (20%) 00 00 00 00 03 (60%) Outros sinais * 02 (40%) 02 (40%) 02 (40%) 01 (20%) 01(20%) 02 (40%) Grupo D= doxiciclina; I= doxiciclina e dipropionato de imidocarb; C= controle. * Ataxia; descarga nasal; diarréia; epistaxe; fadiga pós-exercício; pústulas abdominais; respiração ruidosa. TABELA 4. Freqüência absoluta e relativa das principais alterações hematológicas observadas antes e depois de cada tratamento em cães naturalmente infectados por Ehrlichia canis. Grupo D (n=5) Grupo I (n=5) Grupo C (n=5) Alteração hematológica Antes Depois Antes Depois Antes Depois Anemia (< 5,5 x 106 /mm3) 05 (100%) 02 (40%) 02 (40%) 01 (20%) 03 (60%) 04 (80%) Trombocitopenia (< 2 x 104 /mm3) 04 (80%) 02 (40%) 04 (80%) 01 (20%) 02 (40%) 04 (80%) Leucocitose (> 17 x 103 /mm3) 00 00 00 00 01 (20%) 01 (20%) Leucopenia (< 6 x 103 /mm3) 02 (40%) 00 02 (40%) 01 (20%) 00 00 Neutrofilia (> 11.500) 00 00 00 00 01 (20%) 01 (20%) Monocitose (> 1.350) 01 (20%) 00 01 (20%) 00 04 (80%) 03 (60%) Linfopenia (< 1.000) 03 (60%) 00 01 (20%) 02 (40%) 00 02 (40%) Presença de mórula 05 (100%) 01 (20%) 05 (100%) 00 05 (100%) 02 (40%) Outras alterações * 05 (100%) 03 (60%) 05 (100%) 02 (40%) 05 (100%) 05 (100%) Grupo D= doxiciclina; I= doxiciclina e dipropionato de imidocarb; C= controle. * Aglomerados leucocitários; anisocitose; basofilia citoplasmática; corpúsculos de Howell-Jolly; crenação; eritrofagocitose; granulação tóxica; linfócitos reacionais; macroplaquetas; metarrubrócitos; monócitos ativados; poiquilocitose; policromatofilia; rouleaux; vacuolização tóxica. TABELA 5. Valores individuais de temperatura retal em graus Celsius dos animais pertencentes aos três grupos de tratamento. CONTROLE Animal C-01 C-02 C-03 C-04 C-05 Dia 0 38,6 38,5 39,4 38,7 39,7 Dia 7 38,7 38,5 39,6 38,5 38,5 Dia 14 38,7 39,8 38,9 39,2 39,0 Dia 21 38,8 40,1 39,5 38,8 38,6 Dia 28 38,9 40,1 39,0 38,6 38,7 DOXICICLINA Animal D-01 D-02 D-03 D-04 D-05 Dia 0 40,5 40,0 39,0 40,1 39,2 Dia 7 39,0 38,4 38,8 40,5 39,1 Dia 14 39,0 40,1 38,5 39,9 40,7 Dia 21 38,7 39,5 38,6 40,4 40,4 Dia 30 38,7 39,4 38,8 39,2 36,5 DOXICICLINA e DIPROPIONATO DE IMIDOCARB Animal I-01 I-02 I-03 I-04 I-05 Dia 0 39,4 39,3 39,4 39,6 39,9 Dia 7 40,3 38,9 40,1 40,0 39,0 Dia 14 40,0 38,9 38,5 39,2 38,8 Dia 21 39,8 39,5 39,5 39,5 39,5 Dia 44 39,3 39,0 38,3 39,3 38,5 TABELA 6. Valores individuais de hemácias x 106 em milímetros cúbicos dos animais pertencentes aos três grupos de tratamento. CONTROLE Animal C-01 C-02 C-03 C-04 C-05 Dia 0 5.900.000 4.200.000 2.600.000 6.800.000 4.000.000 Dia 7 5.500.000 4.200.000 3.600.000 6.600.000 4.500.000 Dia 14 4.900.000 4.300.000 4.300.000 6.600.000 4.700.000 Dia 21 4.900.000 4.200.000 4.400.000 6.400.000 4.500.000 Dia 28 5.000.000 4.200.000 4.300.000 6.400.000 4.200.000 DOXICICLINA Animal D-01 D-02 D-03 D-04 D-05 Dia 0 4.300.000 3.700.000 4.300.000 2.700.000 4.000.000 Dia 7 6.100.000 3.900.000 3.700.000 1.900.000 3.200.000 Dia 14 6.400.000 4.200.000 5.100.000 2.100.000 3.900.000 Dia 21 6.200.000 4.700.000 5.800.000 4.900.000 3.700.000 Dia 30 6.900.000 4.000.000 5.800.000 5.500.000 2.800.000 DOXICICLINA e DIDPROPIONATO DE IMIDOCARB Animal I-01 I-02 I-03 I-04 I-05 Dia 0 5.500.000 5.500.000 5.300.000 7.900.000 4.400.000 Dia 7 5.000.000 5.100.000 4.800.000 5.800.000 6.300.000 Dia 14 5.600.000 6.300.000 4.000.000 5.500.000 4.300.000 Dia 21 6.000.000 5.000.000 3.600.000 5.000.000 4.000.000 Dia 44 6.200.000 5.500.000 4.100.000 5.600.000 5.700.000 Valores de referência: 5,5 a 8,5 x 106/mm3. TABELA 7. Valores individuais de hematócrito em porcentagem dos animais pertencentes aos três grupos de tratamento. CONTROLE Animal C-01 C-02 C-03 C-04 C-05 Dia 0 42 32 18 47 29 Dia 7 38 32 27 47 33 Dia 14 34 30 31 47 35 Dia 21 32 30 29 45 32 Dia 28 36 30 32 45 32 DOXICICLINA Animal D-01 D-02 D-03 D-04 D-05 Dia 0 32 26 32 20 29 Dia 7 44 27 27 14 21 Dia 14 47 30 36 16 27 Dia 21 45 32 40 37 26 Dia 30 50 28 42 44 21 DOXICICLINA e DIDPROPIONATO DE IMIDOCARB Animal I-01 I-02 I-03 I-04 I-05 Dia 0 38 38 35 52 31 Dia 7 34 35 34 40 42 Dia 14 39 45 28 39 30 Dia 21 42 34 26 34 30 Dia 44 43 37 27 38 40 Valores de referência: 37 a 55%. TABELA 10. Valores individuais de monócitos em número absoluto dos animais pertencentes aos três grupos de tratamento. CONTROLE Animal C-01 C-02 C-03 C-04 C-05 Dia 0 1.416 2.640 620 1.605 3.150 Dia 7 1.310 2.640 1.595 1.407 2.919 Dia 14 855 504 2.358 2.002 3.480 Dia 21 1.045 2.992 3.752 1.455 3.914 Dia 28 1.128 2.992 3.680 1.310 3.090 DOXICICLINA Animal D-01 D-02 D-03 D-04 D-05 Dia 0 92 576 3.680 957 1.200 Dia 7 696 1.848 2.058 341 420 Dia 14 240 2.119 891 780 1.700 Dia 21 340 1.701 783 985 1.404 Dia 30 300 798 279 357 202 DOXICICLINA e DIDPROPIONATO DE IMIDOCARB Animal I-01 I-02 I-03 I-04 I-05 Dia 0 1.580 1.131 540 1.148 624 Dia 7 918 553 806 315 496 Dia 14 342 474 38 390 282 Dia 21 649 606 135 234 469 Dia 44 704 576 156 360 539 Valores de referência: 150 a 1350. TABELA 11. Valores individuais de linfócitos em número absoluto dos animais pertencentes aos três grupos de tratamento. CONTROLE Animal C-01 C-02 C-03 C-04 C-05 Dia 0 3.658 1.540 1.860 2.782 2.850 Dia 7 3.799 1.540 435 2.278 2.641 Dia 14 3.610 168 2.096 1.729 1.914 Dia 21 3.230 136 2.814 3.104 206 Dia 28 4.136 136 2.240 4.192 824 DOXICICLINA Animal D-01 D-02 D-03 D-04 D-05 Dia 0 92 1.600 2.240 667 160 Dia 7 2.088 2.376 3.332 154 360 Dia 14 1.560 4.401 2.673 312 1.600 Dia 21 1.904 1.458 1.566 985 1.248 Dia 30 1.125 1.463 1.395 2.142 1.313 DOXICICLINA e DIDPROPIONATO DE IMIDOCARB Animal I-01 I-02 I-03 I-04 I-05 Dia 0 3.318 2.088 2.430 3.854 819 Dia 7 1.377 2.054 2.728 1.512 1.488 Dia 14 513 4.316 266 1.560 376 Dia 21 1.180 3.232 540 1.170 134 Dia 44 1.280 2.976 728 2.520 308 Valores de referência: 1000 a 4800. TABELA 12. Valores individuais de proteína plasmática total em gramas por decilitro dos animais pertencentes aos três grupos de tratamento. CONTROLE Animal C-01 C-02 C-03 C-04 C-05 Dia 0 9,8 7,0 5,6 8,6 5,4 Dia 7 8,8 7,0 5,4 8,4 5,0 Dia 14 9,4 7,4 4,8 8,2 3,2 Dia 21 9,6 6,8 5,0 7,6 3,2 Dia 28 10,2 6,8 5,6 7,8 4,0 DOXICICLINA Animal D-01 D-02 D-03 D-04 D-05 Dia 0 6,4 5,2 5,6 5,8 6,0 Dia 7 7,6 5,3 6,0 5,8 5,5 Dia 14 8,4 5,2 5,4 6,2 5,6 Dia 21 7,6 5,6 6,4 10,8 6,4 Dia 30 8,0 5,6 6,4 7,4 4,9 DOXICICLINA e DIDPROPIONATO DE IMIDOCARB Animal I-01 I-02 I-03 I-04 I-05 Dia 0 6,2 6,8 10,4 5,6 6,4 Dia 7 6,8 6,4 9,0 5,6 5,8 Dia 14 6,6 6,8 7,0 5,2 6,2 Dia 21 6,6 6,0 5,8 5,8 7,2 Dia 44 6,4 6,4 6,0 7,0 7,2 Valores de referência: 6,0 a 8,0 g/dl.