Extração e eletroforese

Extração e eletroforese

(Parte 1 de 4)

MSc. Ana Liedke

Fundamentos de Extração de DNA e RNA

Importância

Uso de DNA para estudos de natureza variada: •diagnóstico (sensível e específico);

•medicina (estudo do câncer; identificação doenças);

•processos evolutivos (filogenias, estudos populacionais);

• geno ma

•investigações de perícia, paternidade...

Uso de RNA para estudos de natureza variada: •Transcrição Reversa do RNA (cDNA);

•Análises de expressão gênica

•Northern, RT-PCR, construção de bibliotecas de cDNA

Organis mos bactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais

A extração e a purificação de ácidos nucléicos éuma etapa fundamental para se obter alta eficiência de amplificação nos protocolos que usam a reação em cadeia da polimerase (PCR).

Organis mos bactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais

Tipos de DNA

Eucariontes (núcleo individualizado) •DNA nuclear;

•DNA mitocondrial;

•DNA cloroplasto;

Tipos de DNA

Eucariontes (núcleo individualizado) •DNA nuclear;

•DNA mitocondrial;

•DNA cloroplasto;

Tipos de DNA

Procariontes (sem núcleo) •DNA circular;

•DNA plasmidial;

Fator adicional: parede celular

Extração de DNA/RNA Extração de DNA/RNA

Extração de DNA/RNA

Passos principais: •lise das membranas plasmáticas e nucleares;

• degradaçã o proteínas;

•purificação do DNA/RNA.

Para cada tipo de amostra, vários protocolos podem ser testados, adaptados e otimizados, de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade.

Extração de DNA/RNA

Passos principais: •lise das membranas plasmáticas e nucleares; solubilizadas por agentes que rompam associações hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica.

detergentes

Extração de DNA/RNA

Passos principais: •lise das membranas plasmáticas e nucleares; solubilizadas por agentes que rompam associações hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica.

detergentes mice las

Extração de DNA/RNA

Passos principais: •lise + degradação proteínas; detergentes Proteinase k

Extração de DNA/RNA

Passos principais: •lise + degradação proteínas; detergentes Proteinase k

A Proteinase K foi descoberta em 1974, no fungo Tritirachium album;

Écapaz de digerir a queratina (Keratin), daío nome “Proteinase K”.

Rapidamente inativa as nucleases, que degradam o DNA e RNA

Extração de DNA/RNA

Passos principais: •lise + degradação proteínas; detergentes Digestão em banho-maria com temperatura próxima a 50°C Proteinase k

O tempo de incubação pode variar. Importante éque a amostra se apresente totalmente digerida

Fenol:desnaturação das proteínas de maneira eficiente, remove as partes orgânicas

Aviso: O fenol éum produto altamente tóxico, irritante para a pele e mucosa s

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