Cromatografia em camada delgada (CCD)

Cromatografia em camada delgada (CCD)

Separação de pigmentos de folhas verdes por Cromatografia em Camada Delgada de Sílica Gel (CCD)

  1. Introdução Teórica

A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. É uma técnica versátil e de grande aplicação, pois possui uma variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias.

O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é atribuída a um botânico russo ao descrever suas experiências na separação dos componentes de extratos de folhas. Nesse estudo, a passagem de éter de petróleo (fase móvel) através de uma coluna de vidro preenchida com carbonato de cálcio (fase estacionária), à qual se adicionou o extrato, levou à separação dos componentes em faixas coloridas. Este é provavelmente o motivo pelo qual a técnica é conhecida como cromatografia (chrom = cor e graphie = escrita), podendo levar à errônea idéia de que o processo seja dependente da cor.

Esta técnica foi praticamente ignorada até a década de 30, quando foi redescoberta. A partir daí, diversos trabalhos na área possibilitaram seu aperfeiçoamento e, em conjunto com os avanços tecnológicos, levaram-na a um elevado grau de sofisticação, o qual resultou no seu grande potencial de aplicação em muitas áreas.

A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura.

As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos critérios:

  • Classificação pela forma física do sistema cromatográfico

Subdividida em Cromatografia em coluna [fig.1] (Cromatografia Líquida Clássica – CLC – para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE – para análises e separações de uma ampla gama de compostos com alta eficiência, utilizada em análises de pesticidas, feromônios, isolamento de produtos naturais e sintéticos e na produção e controle de qualidade de medicamentos; Cromatografia Gasosa de Alta Resolução – CGAR – para identificação imediata de substâncias presentes na amostra) e Cromatografia planar (Cromatografia em Papel – CP – para a separação de compostos polares; Cromatografia em Camada Delgada – CCD –[fig.2] também para a separação de compostos polares; Cromatografia por Centrifugação – Chromatotron).

  • Classificação pela fase móvel empregada

Em se tratando da fase móvel, são três os tipos de cromatografia: Cromatografia Gasosa; Cromatografia Líquida e Cromatografia Supercrítica.

  • Classificação pela fase estacionária utilizada

Quanto à fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionária ser constituída por um líquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados são considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separação.

  • Classificação pelo modo de separação

Por este critério, separações cromatográficas se devem à adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou misturas desses mecanismos. A fig.3 mostra um esquema dos tipos de cromatografia.

  1. Objetivo

  • Entender a preparação do extrato;

  • Aprender a aplicar a amostra na placa de sílica gel;

  • Aprender sobre Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e seus cálculos de Rf (Fator de Retenção);

  • Identificar as substâncias no cromatograma.

  1. Material e Reagentes

  • Éter de petróleo (p.e 80 – 100ºC) ou hexano;

  • Etanol;

  • Clorofórmio (5 mL);

  • Sulfato de Sódio Anidro;

  • Folhas de espinafre ou chanana;

  • Almofariz;

  • Pipeta de Pasteur;

  • Funil de separação de 60 mL;

  • Béquer de 50 mL;

  • Erlenmeyer de 25 mL;

  • Proveta de 10 mL;

  • Papel de filtro;

  • Placa de Petri;

  • Cubetas ou Béquer de 100 mL;

  • Placas de sílica gel;

  • Capilares.

  1. Procedimento Experimental

  1. Preparação do extrato

Colocar em um almofariz 5-10 folhas de espinafre e alguns mililitros de uma mistura de 2:1 de éter de petróleo (fração de p.e 80-100ºC) ou hexano e etanol. Triturar bem as folhas. Utilizando uma pipeta de Pasteur e uma bolinha de algodão, filtrar o extrato, transferindo-o para um funil de separação. Adicionar o mesmo volume d’água. Girar lentamente o funil, pois a agitação brusca pode causar a formação de emulsão (um colóide no qual pequenas partículas de um líquido são dispersas em outro líquido). Separar e descartar a fase aquosa. Repetir esta operação de lavagem por mais duas vezes, sempre descartando a fase aquosa. Transferir a solução de pigmentos para um Erlenmeyer e adicionar aproximadamente 2g de sulfato de sódio anidro. Após alguns minutos, utilizando a pipeta de Pasteur, decantar a solução de pigmentos do sulfato de sódio, transferindo para um béquer. Se a solução não estiver fortemente colorida de verde escuro, concentrar parte do éter de petróleo usando uma suave corrente de ar.

  1. Aplicação da amostra na placa

Utilizando um capilar, foram aplicadas sete porções da solução de pigmentos sobre uma placa de sílica (2,5 x 7,5) a 1,0cm de cada extremidade. Evitar a difusão da mancha de forma que seu diâmetro não deva ultrapassar a 2 mm durante a aplicação da amostra. Deixar o solvente evaporar.

  1. Desenvolvimento do cromatograma

Preparar um cuba colocando uma tira de papel de filtro de 4,0 x 5,0 cm e 5 mL de clorofórmio. Esperar o tempo suficiente para que ocorra a completa saturação. Colocar a placa na cuba, evitando que o ponto de aplicação da amostra mergulhe no solvente. Quando o solvente atingir a outra marca de 1,0 cm no topo da placa, remover a placa e colocar na estufa para secar por aproximadamente 3 minutos. Observar o número de manchar coloridas. Marcar a distância entre o ponto de aplicação do extrato e a frente do solvente, além da distância percorrida por cada substância, iniciando pelo ponto de aplicação até o centro de maior concentração da mancha.

As cores laranja são carotenos, as amarelas são xantofilas e azul esverdeada e verde são clorofila a e b, consecutivamente.

Para calcular o fator de retenção (Rf) mede-se a distância de uma linha à outra para encontrar o valor de X, em seguida, marca-se a distância de cada mancha colorida até a linha inicial e divide-se pelo valor de X. Observe a fórmula: Rf A = a/x ; Rf B = b/x ; Rf C ...

  1. Resultado

Após aplicação do extrato na placa de sílica gel e a introdução do material no béquer com SOMENTE clorofórmio, o líquido foi absorvido rapidamente [fig.4], porém após 20 minutos a absorção ficou cada vez mais lenta e a mancha só pode ser “arrastada” conforme houve o isolamento da entrada de ar (o béquer foi tampado com papel ofício) e, então, a mancha foi “arrastada” até a linha superior da placa de sílica gel [fig.5], concluindo a reação e em seguida foi levada à estufa. Após seca, foram marcadas as manchas e a terceira de cima para baixo só foi possível ser localizada através do UV.

Cálculo de Fator de Retenção (Rf) – só pode ter sido calculado devido à marcação das cores [fig.6]:

X = 4,8

Rf A = 4,8/4,8 = 1

Rf B = 4,5/4,8 = 0,93

Rf C = 3,8/4,8 = 0,79 (UV)

Rf D = 2,8/4,8 = 0,58

Rf E = 2,3/4,8 = 0,47

Rf F = 1,8/4,8 = 0,37

Rf G = 1,4/4,8 = 0,29

Rf H = 0,9/4,8 = 0,18

Figura 6: Placa de sílica gel e suas marcações para o cálculo de Rf

  1. Conclusão

Em relação ao extrato da folha, não houve muito entendimento de como foi sua preparação, pois o experimento da cromatografia foi feito com o extrato já preparado por outras mãos. Entretanto, a aplicação da amostra (extrato) na placa de sílica gel foi bem sucedida.

Foi observado que somente com a utilização de clorofórmio, sem ter a acetona em participação conjunta, além de fazer com que o processo de dispersão das manchas coloridas se torne mais lento, o resultado só será obtido satisfatoriamente se houver o isolamento de ar com a solução.

É importante a visualização em raios UV para que possamos observar todas as manchas coloridas, inclusive as que não são possíveis enxergar a olho nu e, assim, o cálculo de Rf terá um resultado adequado.

Neste experimento observamos a clorofila b, xantofilas e carotenos, pois só houve o aparecimento das cores verde, laranja e amarela. Ou seja, no extrato de espinafre analisado, não havia a clorofila B ou não pode ser analisado devido ao fato de só o clorofórmio ter sido utilizado.

  1. Bibliografia

  • COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introdução a métodos cromatográficos. 6ª ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1995.

  • CHAVES, M.H.; Análise de extratos de plantas por CCD: uma metodologia aplicada à disciplina “Química Orgância”. Química Nova, v. 20, n. 5, p. 560-562, 1997.

  • ROBERTS, R.M.; GILBERT, J.C.; RODEWALD, L.B.; WINGROVE, A.S., Modern experimental organic chemistry, 4th ed, Philadelphia Saunders College Publishing, 1985.

  • DEGANI, A.L.G.; CASS, Q.B.; VIEIRA, P.C., Química Nova na Escola, 1998.

Centro Universitário Estadual da Zona Oeste

Separação de pigmentos de folhas verdes por Cromatografia em Camada Delgada de Sílica Gel (CCD)

Relatório referente à matéria de Química Orgânica do 2º período do Centro Universitário Estadual da Zona Oeste pelos alunos: Kamila Oliveira, Maria Lucia Rangel e Raquel Wainfas.

Rio de Janeiro

Julho/2009

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