Técnicas Histológicas

Técnicas Histológicas

(Parte 1 de 3)

Universidade Federal de Sergipe

Centro de Ciências Biológicas e da Saúde

Departamento de Morfologia

Curso de Farmácia

Técnicas Histológicas

Trabalho apresentado à disciplina de Histologia, curso de Farmácia, 2009/1, na Universidade Federal de Sergipe, UFS.

Por: Antonio Marques Filho

São Cristóvão

2009

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO..............................................................................................................02

MICROSCOPIA.............................................................................................................03

Microscopia Óptica.........................................................................................03

Microscopia Elétrica.......................................................................................05

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS.......................................................................................08

Confecção de lâminas histológicas.................................................................08

Coleta do material...........................................................................................08

Fixação...........................................................................................................08

Inclusão..........................................................................................................09

Microtomia....................................................................................................09

Montagem das lâminas histológicas..............................................................10

Técnica de Criomicrotomia (= microtomia por congelamento).....................................10

Técnicas de Coloração de Cortes Histológicos..............................................................10

Técnicas Utilizadas para Confecção de Lâminas Ósseas...............................................13

Técnicas histoquímicas...................................................................................................14

Técnica da contrastação (microscopia eletrônica)..........................................................14

Técnica de imuno-histoquímica......................................................................................15

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................16

INTRODUÇÃO

A Histologia é o estudo da estrutura do material biológico e das maneiras como os seus componentes se inter-relacionam, tanto estrutural quanto funcionalmente. O estudo da histologia se iniciou com o desenvolvimento de microscópios simples e de técnicas para preparo de material biológico, tornando-o adequado para exame.

Os primeiros histologistas descobriram muito sobre a estrutura do material biológico, estabelecendo a teoria celular da estrutura dos organismos vivos, onde a célula é a unidade básica da arquitetura da maioria dos materiais biológicos.

A histologia nasceu com os primeiros estudiosos que se utilizaram do microscópio: Robert. Hook, Malpighi, Graw, Ham, Fontana e outros, muito antes que Meyer (1819) desse esse nome à ciência que descreve os tecidos animais e vegetais.

A noção de "tecido" foi, contudo, introduzida por Xavier Bichat sem que este anatomista se tivesse utilizado do microscópio. A anatomia estuda os tecidos, isto é, as agregações de células que têm a mesma forma e a mesma função.

Uma particular especialização da histologia é a citologia, considerada a ciência das células. Estuda ela a célula em si, a qual constitui, em definitivo, a base das ciências biológicas, porque a célula é o elemento fundamental de todos os seres vivos.

Citologia e histologia não estudam somente a estrutura da célula e dos tecidos, mas também as relações entre a estrutura e a função, e, portanto, se integram com a fisiologia, com a física e com a química.

MICROSCOPIA

As técnicas e os métodos empregues no estudo da célula têm evoluído e diversificado desde a invenção do microscópio, no séc. XVII, por Antoine Leeuwenhoek e Robert Hook, antes mesmo, aliás, de ter sido estabelecido o conceito de célula. Foi, com efeito, através da exploração das potencialidades deste recém inventado aparelho óptico que diversos naturalistas convergiram para a concepção de que todos os seres vivos, plantas e animais, são constituídos por unidades morfológicas e funcionais, que designaram por células.

O estudo de preparações citológicas ou histológicas exige sistemas de observação adequados, que permitem observar as estruturas. Para essa finalidade o aparelho mais comumente usado é o microscópio óptico que utiliza a luz transmitida. Já o microscópio eletrônico, que utiliza elétrons ao invés de feixes luminosos, é o aparelho mais para estudos de ultra-estrutura.

Os métodos de ensino em Biologia Celular e dos Tecidos baseiam-se principalmente no estudo das estruturas e processos celulares sob as microscopias de luz (ML) e eletrônica (ME), permitindo o reconhecimento da célula como um componente dinâmico e participante do metabolismo corporal. Basicamente, estes estudos utilizam como ferramentas, lâminas com colorações histológicas e histoquímicas, para o estudo à microscopia de luz e telas de cobre contrastadas por metais pesados, para o estudo à microscopia elétrica (de transmissão, de varredura, etc.).

Para se usar o microscópio com eficiência é preciso que ele seja manipulado de modo a reder o máximo de sua capacidade resolutiva, isto é que produza a imagem mais nítida possível.

  • Microscopia Óptica

À microscopia óptica, mais propriamente designada por microscopia fotónica, seguiu-se a invenção de outras microscopias, nomeadamente da microscopia eletrônica, e de técnicas complementares, como a Histologia, que permitiram prosseguir e aprofundar o estudo da arquitetura estrutural da célula quase até ao nível macromolecular.

O microscópio fotónico comum, também designado por microscópio de câmara clara, é um sistema óptico capaz de fornecer, de um objeto, uma imagem ampliada, permitindo a observação de detalhes invisíveis a olho nu.

É constituído basicamente por dois conjuntos de lentes: o conjunto objetiva e o conjunto ocular. A objetiva dá do objeto AB uma imagem real A'B', ampliada e invertida.

A ampliação da objetiva, Aob, é dada pela fórmula:

Aob = A’B’/AB

A ampliação é uma das características ópticas essenciais da objetiva. A ocular, por sua vez, fornece de A’B’ uma imagem virtual A’’B’’ muito afastada, mas que, através do cristalino, se projeta na retina do globo ocular. A ampliação da ocular é função da distância focal (foc) em milímetros:

Aoc = 250/foc

Entre outras, destacam-se, nos microscópios, três características principais: a ampliação, a abertura numérica e o poder de resolução.

Simultaneamente, foram surgindo outras técnicas analíticas, umas que fracionam a célula permitindo isolar por centrifugação alguns dos seus componentes; outras que descem ao nível molecular e perscrutam a composição e o funcionamento da maquinaria química subjacente à vida.

Microscópio fotónico e esquema óptico de formação de imagem

  • Microscopia Elétrica

O desenvolvimento concomitante da microscopia eletrônica e da melhoria nas técnicas de preparação dos tecidos ampliaram consideravelmente o campo de estudo da histologia, pois o microscópio eletrônico é aproximadamente 1000 vezes mais poderoso que o microscópio óptico.

Existem vários tipos de microscópios eletrônicos. Nos reteremos a descrição do microscópio eletrônico de transmissão (MET) e do microscópio eletrônico de varredura (MEV).

A diferença básica entre as duas modalidades de microscopia, consiste no fato de na primeira, a imagem ser produzida por fótons e na segunda, por elétrons. Daí decorrem necessariamente, conseqüências, quer a nível de concepção física dos aparelhos, quer a nível da preparação do material, quer a nível da natureza da imagem e ou ainda da performance da técnica.

  • Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)

O alto poder de resolução do microscópio eletrônico de transmissão, juntamente com o grande aumento, permitem a obtenção de imagens com uma grande riqueza de detalhes.

As imagens no microscópio eletrônico de transmissão são formadas pela excitação de uma tela fluorescente ou um filme fotográfico por elétrons. Esses elétrons são produzidos graças ao aquecimento de um filamento no vácuo. Essas partículas são aceleradas devido a uma diferença de potencial de 60 a 100 Kv existentes entre o cátodo e o ânodo. Esse feixe é defletido por lentes eletromagnéticas, de maneira parecida ao que acontece com a luz no microscópio óptico. O condensador focaliza o feixe de elétrons no plano do objeto, e a objetiva forma sua imagem. Esta imagem é ainda ampliada por uma ou duas lentes que a projetam numa tela fluorescente ou filme fotográfico.

A espessura dos cortes precisa estar entre 20 a 100 nm. Para isso, desenvolveram-se métodos especiais de microtomia, que consistem em fixar os tecidos em aldeído glutárico e tetróxido de ósmio, desidratar e incluir em resinas duras a base de Epóxi, como, por exemplo, as resinas Epon e Araldite.

Os cortes são feitos em ultramicrótomos, nos quais são usados navalhas de vidro ou diamante.

Trajeto dos elétrons (em amarelo) no microscópio eletrônico de transmissão

Então, simplificadamente, o funcionamento do microscópio eletrônico de transmissão se baseia na propriedade que as estruturas têm de desviar ou deixar passar por si os elétrons.

As estruturas que desviam os elétrons são chamadas de elétrons densas e aparecem escuras na imagem, já que os elétrons não chegam até a tela fluorescente. Já as estruturas que são atravessadas pelos elétrons (elétron lúcidas) aparecem claras na imagem, pois os elétrons que incidiram sobre a estrutura conseguem excitar a tela fluorescente ou o filme fotográfico que fica abaixo do corte.

  • Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)

No microscópio eletrônico de varredura a imagem é formada por elétrons refletidos sobre o objeto. Entre a lente eletromagnética e o objeto, é interposta uma bobina de varredura que provoca um desvio do feixe de elétrons, de tal modo que o mesmo vai incidir sobre o objeto ponto a ponto, numa seqüência determinada.

O objeto não se deixa atravessar pelo feixe devido sua espessura e a uma película feita por um jato de material refletor, como ouro, por exemplo. Desse modo, o feixe de elétrons que incide sobre o objeto (chamado feixe primário) sofre reflexões originando elétrons secundários, que são captados por detectores especiais, que geram um sinal elétrico transferido para um monitor de vídeo, formando uma imagem tridimensional da superfície da estrutura.

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