Técnicas Histológicas

Técnicas Histológicas

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Trajeto dos elétrons no microscópio eletrônico de varrimento

Microscópio eletrônico de varrimento

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

A correta observação do material biológico, em microscopia óptica, implica uma série de procedimentos técnicos prévios, que a seguir se descrevem sumariamente. Estes procedimentos, designam-se genericamente por técnicas histológicas.

A técnica histológica visa à preparação dos tecidos destinados ao estudado à microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes.

Muitas são as técnicas utilizadas em histologia. Algumas técnicas freqüentemente são utilizadas em rotinas de laboratórios que proporcionam a visualização das microestruturas dos tecidos.

  • Confecção de Lâminas Histológicas

Para a análise sob microscopia óptica é necessária a confecção de lâminas delgadas dos tecidos que formam os órgãos. Estas lâminas podem ser permanentes ou provisórias.

  • Coleta do Material

Partes de órgãos são retiradas com o auxílio de um bisturi, pinça ou lâmina de barbear. Não é indicada a extração de porções grandes, uma vez que o objetivo final é a obtenção de uma camada fina que possa ser analisada em um microscópio óptico.

  • Fixação do material

Esta etapa consiste na utilização de procedimentos físicos ou químicos para imobilizar as substâncias constituintes das células e dos tecidos, fornecendo maior resistência para suportar as demais etapas. Além disso, os fixadores retardam os efeitos pos-mortem do tecido, mantendo sua arquitetura normal.

Os agentes fixadores mais utilizados são o formol tamponado e o líquido de Bouin. Ambos fixam as proteínas evitando sua degradação.

O formol, por ser mais acessível e de uso simples, é o fixador mais utilizado nas técnicas histológicas. Contudo, seus resultados geralmente não são satisfatórios. Por essa razão é recomendada a dissolução de formol em tampão fosfatado (Junqueira e Junqueira, 1983).

O tempo de fixação dependerá do tamanho do fragmento do tecido, podendo variar entre 06 e 24h. É recomendado que, sempre que possível, não ultrapasse a 3 mm de espessura.

  • Inclusão

Este procedimento consiste na impregnação do tecido com uma substância de consistência firme que permita, posteriormente, seccioná-lo em camadas delgadas. Pelo fácil manuseio e bons resultados, a parafina é a mais utilizada neste procedimento. Como ela não é miscível em água, a primeira etapa da inclusão compreende a desidratação, quando ocorre a retirada da água dos tecidos e a sua substituição por álcool.

A diafanização é a etapa seguinte, com a substituição do álcool, agora presente nos tecidos, por xilol. Finalmente, na impregnação, última etapa, o xilol é substituído por parafina fundida a 60° em pequenos blocos. Neste momento a catalogação do bloco é importante para a posterior identificação da peça.

  • Microtomia

Esta etapa consiste, basicamente, em utilizar um micrótomo para obter cortes

sucessivos, delgados e uniformes, a partir dos blocos de parafina com as peças incluídas. Este aparelho é formado por uma lâmina (fixa ou descartável) de aço, afiada, e um braço ao qual se prende o bloco e que se desloca verticalmente.

Micrótomo (tipo “rotativo”) e operação de corte

É difícil obter cortes abaixo de 3 a 4 micrômetros de espessura dos materiais incluídos em parafina. De um modo geral, são obtidos cortes entre 5 e 7 micrômetros.

  • Montagem das lâminas histológicas

As fitas obtidas a partir do micrótomo são transferidas para um banho-maria, com o auxílio de uma pinça, para serem distendidas (Fig. 1 B). A água deve estar entre 3° e 8º abaixo do ponto de fusão da parafina utilizada.

Nesta etapa, são retiradas as dobras e evitadas as bolhas abaixo da fita. Após a distensão, os cortes são separados individualmente ou em grupos, conforme a conveniência, utilizando se lâminas de vidro previamente limpas com detergente, estocadas em álcool 80% e previamente secas. Antes da utilização das lâminas, é necessário revestir suas superfícies com uma fina camada de albumina para facilitar a adesão da peça.

Os cortes obtidos podem ser transferidos, inicialmente, para uma estufa onde ficam alguns minutos (não mais que dez minutos) para posteriormente serem colocados em um suporte inclinado. Finalmente, os cortes devem ser depositados em uma estufa a 60º para secagem entre uma e 24 horas.

  • Técnica de Criomicrotomia (= Microtomia por Congelamento)

A técnica descrita acima, sem dúvida, é a mais utilizada. Contudo, em alguns casos, esta técnica é contra-indicada, como, por exemplo, no estudo da distribuição dos lipídios, em técnicas histoquímicas avançadas ou quando são necessários cortes urgentes, como em exames patológicos. Nestes casos, os tecidos são endurecidos através do congelamento. Os aparelhos utilizados para os cortes podem ser de dois tipos: micrótomos de congelamento ou criostatos (Junqueira e Junqueira, 1983).

O criostato é um aparelho mais aperfeiçoado que o anterior. Permite a obtenção de cortes muito mais finos de tecidos não fixados (até dois micrômetros), facilitando a visualização das células (Junqueira e Junqueira, 1983).

  • Técnicas de Coloração de Cortes Histológicos

A coloração consiste numa etapa muito importante para a visualização das estruturas do tecido. Normalmente são utilizados corantes hidrossolúveis, sendo necessário, deste modo, a remoção da parafina da peça que foi preparada nas etapas descritas anteriormente e que permanece na lâmina de vidro.

Existem muitos tipos de corantes, mas de um modo geral podem ser agrupados em três classes distintas (Gartner e Hiatt, 1999):

  • Corantes que diferenciam os componentes ácidos e básicos das células;

  • Corantes especializados que diferenciam os componentes fibrosos da matriz extracelular;

  • Sais metálicos que precipitam nos tecidos.

Os corantes mais utilizados nos procedimentos histológicos são a Hematoxilina e a Eosina (HE).

A Hematoxilina é uma base que cora, preferencialmente, componentes ácidos das células em um tom azulado escuro. Como os componentes ácidos mais abundantes são o DNA e o RNA, tanto o núcleo, quanto certas partes do citoplasma, se tornam azulados. Esses componentes são chamados de basófilos.

A Eosina, ao contrário, é um ácido que cora as estruturas básicas da célula de rosa. Estas estruturas são abundantes no citoplasma e são chamadas de acidófilas (Gartner e Hiatt, 1999).

Outros corantes são também utilizados em procedimentos de rotina em laboratórios, tais como (Gartner e Hiatt, 1999):

  • Tricrômico de Masson - cora o núcleo de azul escuro, o citoplasma, a queratina e o músculo de vermelho e o mucigênio e o colágeno de azul claro;

  • Orceína - cora as fibras elásticas de marrom;

  • Weigert - cora as fibras elásticas de azul;

  • Prata - cora as fibras reticulares de preto;

  • Hematoxilina férrica - cora as estriações dos músculos, os núcleos e os eritrócitos de preto;

  • Ácido periódico reativo de Schiff – cora as moléculas ricas em glicogênio e carboidrato de magenta;

  • Wright e Giemsa - especializado em células sangüíneas, cora de rosa os eritrócitos e os grânulos eosinófilos, de púrpura o núcleo dos leucócitos e grânulos basófilos e de azul o citoplasma dos monócitos e dos linfócitos.

Para corar peças incluídas em parafina é necessária a retirada da parafina e a hidratação da peça.

Este procedimento é realizado a partir de uma seqüência de banhos em xilol, álcool e água, inversamente ao procedimento executado na etapa de inclusão.

Após a hidratação, os cortes são corados de acordo com o procedimento mais apropriado para a análise que será realizada posteriormente.

Aqui serão abordadas as etapas do método da hematoxilina-eosina, por ser o mais utilizado e por ter um resultado final satisfatório.

  • Técnica da hematoxilina-eosina (HE)

a) Material necessário para a solução de Hematoxilina de Harris (Junqueira e Junqueira, 1983):

- Hematoxilina ______________________ 2,5g

- Álcool 100% _____________________ 25ml

- Alúmen de amônio ou potássio ______ 50g

- Água destilada ___________________ 500ml

- Óxido vermelho de mercúrio _______ 1,25g

- Ácido acético _____________________ 20ml

Inicialmente, a Hematoxilina deve ser dissolvida no álcool e o alúmen na água destilada (previamente aquecida). Posteriormente, as duas soluções devem ser misturadas e aquecidas até a fervura.

O óxido de mercúrio é adicionado à solução que deve ser resfriada, mergulhando-se o frasco em água fria. O ácido acético é então colocado na solução fria para finalmente ser filtrada. O prazo de envelhecimento desta solução é entre dois e três meses. A partir desta data o corante perde suas propriedades e não reage adequadamente com o tecido.

b) Material necessário para a Eosina (Junqueira e Junqueira, 1983):

- Eosina solúvel em água _______________ 1g

- Água destilada ___________________ 100ml

c) Procedimentos para a coloração:

Embora as etapas possam ser definidas, o tempo em cada fase depende da qualidade e da idade das soluções dos corantes. Deste modo, poderá ser observada nas etapas abaixo uma variação muito grande em relação ao tempo que pode ser ajustado durante o procedimento no laboratório.

De acordo com Junqueira e Junqueira (1983), as etapas são:

1º) desparafinar e hidratar os cortes;

2º) corar em hematoxilina entre 5 e 15min;

3º) lavar em água corrente por 10min;

4º) corar em eosina entre 1 e 10min;

5º) lavar em água e desidratar em álcool 70% rapidamente;

6º) diafanizar e montar em resina.

d) Montagem Final da Lâmina:

Este processo consiste em depositar uma gota de resina líquida sobre o corte que está aderido à lâmina de vidro e cobri-lo com uma lamínula. Nesta etapa deve-se evitar as bolhas de ar que se formam na resina durante a colocação da lamínula. Finalmente a lâmina é catalogada.

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