Fitase

Fitase

(Parte 1 de 6)

CURITIBA 2008

Trabalho apresentado à disciplina de Engenharia Enzimática do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Federal do Paraná.

Professor Dr. Carlos Ricardo Soccol

1. INTRODUÇÃO

Fitase (mio-inositol-hexaquifosfato fosfohidrolase, EC 3.1.3.8) é uma enzima que catalisa a liberação do fosfato de fitato (mio-inositol hexaquifosfato), o qual é a principal forma de fósforo predominantemente ocorrendo em grãos cereais, legumes e sementes oleaginosas (PANDEY, A, 2001). Onde o ácido fítico armazenado compreende de 1 a 5% em peso (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

Ácido fítico e intermediários de inositol têm sido incluídos na resposta de glucose do sangue, diminuindo o colesterol e triglicerídeos, na formação de tumores, no tratamento da doença de Parkinson, doença de Alzheimer e esclerose múltipla (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

A hidrólise do ácido fítico (fitato) a mio-inositol e ácido fosfórico é considerada como um importante processo metabólico em vários biosistemas. A sensibilização da sociedade e os regulamentos, cada vez mais exigentes, do mundo de controle sobre poluição agrícola, particularmente na poluição de fósforo (P), que limita o conteúdo de fósforo no estrume, têm intensificado a pesquisa sobre as fitases. O foco tem sido principalmente sobre a produção de fitase e sua utilização como um meio de reduzir a suplementação fósforos inorgânicos na alimentação e conseqüente redução na excreção fecal de fósforo. A poluição ambiental, devido ao estrume com muito fosfato, tem resultado na acumulação de fosfato em várias localizações, especialmente em corpos de água. A suplementação de fitase pode reduzir a quantidade de fosfato no estrume para aproximadamente 30% (PANDEY, A, 2001).

Fitases são consideradas de grande valor no melhoramento da qualidade nutricional de ração, aumentando a quantidade de fosfato disponível. Fitase também melhora a bio-disponibilidade de fosfato de fitato em alimentos vegetais para humanos. Dois grupos importantes de animais, porcos e aves, carecem da enzima necessária para a digestão eficiente do fitato nas rações (PANDEY, A, 2001).

Existem três grandes problemas gerados pela falta de fitases e incapacidade de digestão de fósforo de fitato pelos animais monogástricos. Primeiro, o fósforo da alimentação não aproveitado acaba no estrume, causando sérios problemas de poluição ambiental em áreas de intensa pecuária. (KIM, T., 2006)

Um dos problemas ambientais global é o da eutrofização, que ocorre quando o fosfato acaba em rios, propiciando o crescimento de cianobactérias, hipóxia e morte de animais aquáticos (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

Segundo, é necessário a suplementação de fosfato inorgânico na dieta de suínos, aves e peixes para satisfazer as exigências nutricionais de fósforo. Isso representa um custo significativo na alimentação animal. Terceiro, o fósforo inorgânico é não-renovável, e os acessos fáceis ao fósforo inorgânico em terra podem estar exauridos em 80 anos, com a atual taxa de extração. Em excesso, o fitato pode quelar oligoelementos, como ferro e zinco, causando deficiência generalizada desses nutrientes em populações cuja alimentação é baseada em leguminosas. (KIM, T., 2006)

No entanto, para crescimento ósseo correto, esses animais necessitam de fosfato em concentrações adequadas. Isso cria uma situação complexa. Mas a suplementação de fitase à alimentação fornece uma alternativa para enfrentar efetivamente essas duas condições (PANDEY, A, 2001).

Uma abordagem alternativa para diminuir o teor de ácido fítico em produtos agrícolas poderia ser o uso de métodos químicos, no entanto, esses métodos geralmente são caros e afetam a qualidade nutricional do produto (PANDEY, A, 2001).

A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) em consulta com a IUPAC-IUB, Comissão Mista em Nomenclatura Bioquímica (JCBN) listam dois tipos de fitases: EC 3.1.3.8 e EC 3.1.3.26 (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

EC 3.1.3.8 Nome recomendado: 3-fitase Nome sistemático: mio-inositol hexaquis fosfato-3-fosfohidrolase Hidrolisa a ligação éster na terceira posição de mio-inositolhexaquisfosfato em dmio-inositol-1,2,4,5,6-pentaquisfosfato e ortofosfato (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

EC 3.1.3.26 Nome recomendado: 6-fitase Nome sistemático: mio-inositol hexaquis fosfato-6-fosfohidrolase Hidrolisa a ligação éster na sexta posição do mio-inositolhexaquisfosfato em dmio-inositol-1,2,3,4,5-pentaquisfosfato e ortofosfato. Subseqüentes ligações éster no substrato foram hidrolisadas em diferentes taxas. Em um estudo recente, Mullaney e

Ullah, descreveram três classes de fitases baseadas em diferenças estruturais e propriedades catalíticas variadas. Estas incluem membros de fosfatases de histidina ácida (HAPs), β-propeller fitase (BPP) e fosfatases ácido roxas (PAP) (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

Dos vários tipos de fitases de histidina ácida, phyA e phyB são os representantes mais amplamente caracterizados. Uma é caracterizada como fitase (phyA) com dois pHs ótimos (2,5 e 5,0) e foi fortemente glicosilada com um peso de molecular de 85 KDa, enquanto o monômero de proteína foi desglicosilado de 48,5 KDa. Verificou-se que a enzima manteve-se estável por meses em filtrado de cultura bruta e mostrou termoestabilidade inerente, possuindo uma temperatura ótima de 58ºC, com 10 resíduos de cisteína envolvidos em formar cinco pontes dissulfeto. O papel da glicosilação na expressão funcional da phyA foi estudado por diversos autores e achou-se vital para a termoestabilidade da enzima (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

A secunda enzima é a phyB, que foi inicialmente referida com pH ótimo de 2,5 de fosfatase ácida. A enzima perde a atividade degradadora de fitato em pH 5,0 enquanto em pH 2,5 ela hidrolisa eficientemente fitato com um número de queda de 628 s-1 se comparado a 348 s-1 para phyA. Isso foi atribuído a distribuição de carga em sítios específicos do substrato de phyA e phyB (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

Várias fitases foram reportadas na literatura que não possuem motivos de sítio ativo e motivos HD (explicados na parte de AÇÃO), por isso, têm requerimentos diferentes para a ação catalítica. KEREVUO et al. isolou, purificou, caracterizou e clonou fitase extracelular de Bacillus subtilis VTT E-68013. A enzima teve atividade máxima a 55ºC, pH 7,0, requerendo Ca+2 para atividade e estabilidade. E não mostrou homologia com a seqüência do sítio ativo de HAPs, por isso, designada como phyC tendo atividade de fitase. GREINER et al. reportaram uma monomérica de 40 KDa, 3-fitase de Klebsiella terrigena, a qual assim como a phyA tem temperatura ótima de 58ºC e não é uma metaloenzima. SEGUEILHA et al. purificaram e caracterizaram a fitase de Schwanniomyces castellii que tem peso molecular de 490 Kda (tetrâmero) com uma larga subunidade (125Kda) e três subunidades identidades (70 Kda). SANO et al. reportou uma fitase secretora de Arrula adeninivorans tendo uma temperatura e pH ótimos de 75ºC e 4,5, respectivamente. O nível de enzimas secretadas excede ao reportado anteriormente das fitases de levedura, mas a enzima não era resistente ao calor na ausência de fitato. A fitase de soja não mostrou homologia na seqüência com nenhuma fosfatase de histidina ácida e foi encontrada como homóloga ao N-terminal da fosfatase ácido roxas de Arabidopsis thalliana. Em geral, fitases produzidas por bactérias tem pH ótima na faixa neutra a alcalina com baixo rendimento, que impede os seu uso como aditivo de alimentos (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

A Figura 1 mostra a estrutura da molécula de fitase e a Figura 2 mostra apresenta uma imagem da estrutura superficial dessa enzima. Figura 1: Imagem 3D gerada em computador da molécula de fitase

Fonte: Freeing Phosphorus. Disponível em: <w.ars.usda.gov/is/AR/archive/ jul06/phos0706.htm>. Acesso em: 2/04/08.

Figura 2: Imagem da estrutura superficial da molécula de fitase

Fonte: Freeing Phosphorus. Disponível em: <w.ars.usda.gov/is/AR/archive/ jul06/phos0706.htm>. Acesso em: 2/04/08.

1. AÇÃO

A fitase catalisa a hidrólise de fosfomonoésteres de ácido fítico (mio-inositol hexaquisfosfato, IP6), retirando o grupo fosfato e formando, seqüencialmente, mio- inositol pentaquis-, tetraquis-, tris-, bis-, e mono-fosfatos (IP5 IP4 IP3 IP2 IP1), assim como fosfato inorgânico (VATS e BANERJEE, 2004).

O fitato possui seis grupos que podem ser liberados, dependendo da fitase utilizada, em velocidades e ordem diferentes. Na conformação energética mais favorável do fitato (Figura 3), cinco dos grupos fosfatos estão em posição equatorial, enquanto o outro está em posição axial. As fitases fúngicas e de E. coli conseguem liberar somente cinco dos seis grupos (somente aqueles que estão em posição equatorial), sendo que os produtos finais são mio-inositol 2-monofosfato (WYSS et al., 1999).

Figura 3: Conformação energética mais favorável do ácido fítico.

Fonte: WYSS et al., 1999.

O acompanhamento da retirada dos fosfatos foi estudado por Mitchell et al. (2008). Observou-se que a retirada dos grupos fosfatos das posições equatoriais acontecia rapidamente, enquanto a hidrólise do grupo axial acontecia tão lentamente que a conversão total do fitato a mio-inositol monofosfato estava completa antes do aparecimento do mio-inositol livre (Figura 4).

A especificidade da enzima pelos intermediários da reação também muda, como mostra a Figura 4. Fez-se a comparação da especificidade com relação a primeira reação, portanto, a primeira reação aparece no gráfico como especificidade

1. Observa-se que a enzima apresenta uma maior especificidade por IP5 e ela vai diminuindo para as outras formas (MITCHELL et al., 2008).

Figura 4- Acompanhamento da formação de produtos (esquerda) e especificidade da fitase de várias fontes (A-F) pelos intermediários (direita)

Com base nas propriedades bioquímicas Oh et al. (2004) dividiu as fitases em duas classes. A primeira delas é a fitase de histidina ácida que contém os grupos phyA, phyB e phyC e abrange a maioria das fitases bacterianas e fúngicas (KEROVUO, 2000).

Dentre as fitases do grupo fosfatases de histidina ácida, as que foram melhores caracterizadas são a phyA e a phyB. Essas enzimas possuem um motivo protéico conservado (Arg-His-Gly-X-Arg-X-Pro) da classe das ácido fosfatases, proporcionando a hidrólise de fosfomonoésteres em duas etapas reacionais (VATS e BANERJEE, 2004). Nesse sítio ativo, existem resíduos como histidina e arginina, que em pH ácido apresenta carga positiva, a qual pode interagir com as cargas negativas da molécula de fitato (VAN ETTEN et al., 1991). A carga positiva do grupo guanidina da arginina do resíduo Arg-His-Gly interage diretamente com o grupo fosfato do fitato, deixando-o mais suscetível ao ataque nucleofílico da histidina. A histidina serve como nucleófilo e faz uma ligação covalente, formando um intermediário (fosfohistidina). O ácido aspártico presente num resíduo C-terminal doa um próton ao substrato, o qual é liberado da enzima sem o grupo fosfato (KEROVUO, 2000).

As fitases denominadas phyC não apresentam o motivo protéico Arg-His-Gly-

X-Arg-X-Pro no sítio ativo, e, portanto, tem uma ação catalítica diferente. Elas também necessitam da presença de íons cálcio para a atividade e estabilidade da enzima (VATS e BANERJEE, 2004). O grupo das fitases alcalinas contém as phyD. Elas necessitam do complexo fitato-cálcio para serem ativas e trabalham em pH alcalino (KEROVUO, 2000).

O mecanismo de reação para fitases phyC, ou também chamadas de fitases β-propulsoras devido a sua configuração espacial, consiste num sítio ativo que contém de 3 a 6 átomos de cálcio ligados no qual irá penetrar um grupo fosfato. Existe também um outro sítio de ligação para um segundo grupo fosfato, mas esse sítio não é catalítico. Quando o fosfato liga-se nesse segundo sítio há uma alteração na conformação da fitase de modo que sua atividade é melhorada. O íon fosfato que irá ser liberado está perto de uma molécula de água e irá ser atacado pelo íon hidróxido. Ocorre então o ataque da ligação entre o grupo fosfato e o mio-inositol por um resíduo ácido de aminoácido, resultando na liberação do fosfato (SHIN et al., 2001).

Elas também podem ser divididas em três tipos: 3-fitase (mio-inositol hexaquisfosfato 3-fosfohidrolase, EC 3.1.3.8), que contém os grupos phyA e phyB, pois começam a fazer a hidrólise do fitato preferencialmente na posição do carbono

3; 6-fitase (mio-inositol hexaquisfosfato 6-fosfohidrolase, EC 3.1.3.26), contendo a phyC e começando a hidrólise preferencialmente pela posição C-6; e 5-fitase (mioinositol hexaquisfosfato 5-fosfohidrolase, EC 3.1.3.72), contendo phyD, que inicia a quebra do fitato pelo carbono 5. A 3-fitase é mais encontrada em microrganismos, a 6-fitase e 5-fitase em plantas (KEROVUO, 2000).

A especificidade de substrato de fitases produzidas por E. coli e A. niger foi testada por Wyss e colaboradores utilizando diferentes compostos fosfatados (pnitrofenil fosfato, fenil fosfato, frutose 1,6-bifosfato, frutose 6-fosfato, glucose 6- fosfato, ribose 5-fosfato, α-glicerolfosfato, β-glicerofosfato, 3-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato, AMP, ADP, e ATP). Foi apresentada uma boa atividade catalítica com os três primeiros substratos, além do fitato, para a maioria das fitases testadas. As fitases de A. niger e E. coli foram as que apresentaram maior especificidade para fitato (WYSS et al., 1999).

Os fosfatos do fitato são carregados negativamente, e por isso, podem quelar íons positivos como Ca2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, Fe2+ e K+, diminuindo a absorção desses minerais por animais de criação como porcos e aves (Figura 5). Ele pode também pode se integrar a íons positivos de proteínas, aminoácidos, carboidratos e lipídios, diminuindo sua solubilidade e digestibilidade. A fitase também pode interagir com resíduos de lisina e arginina de enzimas como tripsina e outras proteases, diminuindo a atividade delas (NOCERA, 2005; Phytase and Layer Diets).

Figura 5: Fitato quelando íons Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+, e Fe2+

Fonte: <w.spesfeed.co.za/winter99.htm>

Íons metálicos e reagentes sulfidril podem modular a atividade da fitase. No entanto, não é provável que íons como Cu2+, Fe3+, Fe2+, Al3+, e Mn2+ se liguem diretamente à enzima para diminuir sua atividade, mas sim através da interação dos íons com o fitato, que assim não consegue se ligar fortemente a enzima. Em algumas fitases, o detergente EDTA pode aumentar a atividade, enquanto em outras como a phyC Bacillus subtilis que necessitam íons metálicos como Ca2+, o EDTA diminui a atividade (WYSS et al., 1999).

2. FONTES

2.1. Vegetal

A fitase já foi encontrada em várias fontes vegetais, como trigo, milho, algumas ervas como faba, arbustos como mung, alfaces, centeio e sementes oleaginosas, sendo que a atividade mais alta foi encontrada no trigo, no centeio e na cevada. As fitases obtidas de sementes em germinação e polém têm sido purificadas e caracterizadas. Fitase alcalina também tem sido identificada no pólem de Lilium longiflorum, Typha latifólia e em sementes de legumes (ROOPESH, K et al.).

Aos vegetais, geralmente, atribuem-se baixos valores de fitase, mas

Jongbloed e Kemme (1990) e apud COLE (1991) demonstraram que a fitase do trigo pode melhorar a digestibilidade do fósforo de 27 para 50%. No entanto, para que se extraia a enzima de fontes vegetais em alta produção, é necessário um longo tempo para a germinação e um processo de extração em vários estádios, usando materiais perigosos, como hexano (NEWMAN, 1991). Ademais, KORNEGAY (1996) demonstrou que a fitase do trigo atua em um limite de pH bem menor do que a fitase fúngica e ressaltou algumas vantagens da fitase fúngica sobre a de origem vegetal, como a de ter atividade conhecida e ser estável. (FIREMAN, A. K. B. A. T. et al., 1998.)

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