Baixe Fitase - Apostilas - Biotecnologia Parte1 e outras Notas de estudo em PDF para Biotecnologia, somente na Docsity! UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ FITASE CURITIBA 2008 Trabalho apresentado à disciplina de Engenharia Enzimática do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Federal do Paraná. Professor Dr. Carlos Ricardo Soccol 1. INTRODUÇÃO Fitase (mio-inositol-hexaquifosfato fosfohidrolase, EC 3.1.3.8) é uma enzima que catalisa a liberação do fosfato de fitato (mio-inositol hexaquifosfato), o qual é a principal forma de fósforo predominantemente ocorrendo em grãos cereais, legumes e sementes oleaginosas (PANDEY, A, 2001). Onde o ácido fítico armazenado compreende de 1 a 5% em peso (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004). Ácido fítico e intermediários de inositol têm sido incluídos na resposta de glucose do sangue, diminuindo o colesterol e triglicerídeos, na formação de tumores, no tratamento da doença de Parkinson, doença de Alzheimer e esclerose múltipla (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004). A hidrólise do ácido fítico (fitato) a mio-inositol e ácido fosfórico é considerada como um importante processo metabólico em vários biosistemas. A sensibilização da sociedade e os regulamentos, cada vez mais exigentes, do mundo de controle sobre poluição agrícola, particularmente na poluição de fósforo (P), que limita o conteúdo de fósforo no estrume, têm intensificado a pesquisa sobre as fitases. O foco tem sido principalmente sobre a produção de fitase e sua utilização como um meio de reduzir a suplementação fósforos inorgânicos na alimentação e conseqüente redução na excreção fecal de fósforo. A poluição ambiental, devido ao estrume com muito fosfato, tem resultado na acumulação de fosfato em várias localizações, especialmente em corpos de água. A suplementação de fitase pode reduzir a quantidade de fosfato no estrume para aproximadamente 30% (PANDEY, A, 2001). Fitases são consideradas de grande valor no melhoramento da qualidade nutricional de ração, aumentando a quantidade de fosfato disponível. Fitase também melhora a bio-disponibilidade de fosfato de fitato em alimentos vegetais para humanos. Dois grupos importantes de animais, porcos e aves, carecem da enzima necessária para a digestão eficiente do fitato nas rações (PANDEY, A, 2001). Existem três grandes problemas gerados pela falta de fitases e incapacidade de digestão de fósforo de fitato pelos animais monogástricos. Primeiro, o fósforo da alimentação não aproveitado acaba no estrume, causando sérios problemas de poluição ambiental em áreas de intensa pecuária. (KIM, T., 2006) das fitases de levedura, mas a enzima não era resistente ao calor na ausência de fitato. A fitase de soja não mostrou homologia na seqüência com nenhuma fosfatase de histidina ácida e foi encontrada como homóloga ao N-terminal da fosfatase ácido roxas de Arabidopsis thalliana. Em geral, fitases produzidas por bactérias tem pH ótima na faixa neutra a alcalina com baixo rendimento, que impede os seu uso como aditivo de alimentos (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004). A Figura 1 mostra a estrutura da molécula de fitase e a Figura 2 mostra apresenta uma imagem da estrutura superficial dessa enzima. Figura 1: Imagem 3D gerada em computador da molécula de fitase Fonte: Freeing Phosphorus. Disponível em: <www.ars.usda.gov/is/AR/archive/ jul06/phos0706.htm>. Acesso em: 22/04/08. Figura 2: Imagem da estrutura superficial da molécula de fitase - Fonte: Freeing Phosphorus. Disponível em: <www.ars.usda.gov/is/AR/archive/ jul06/phos0706.htm>. Acesso em: 22/04/08. 1. AÇÃO A fitase catalisa a hidrólise de fosfomonoésteres de ácido fítico (mio-inositol hexaquisfosfato, IP6), retirando o grupo fosfato e formando, seqüencialmente, mio- inositol pentaquis-, tetraquis-, tris-, bis-, e mono-fosfatos (IP5 IP4 IP3 IP2 IP1), assim como fosfato inorgânico (VATS e BANERJEE, 2004). O fitato possui seis grupos que podem ser liberados, dependendo da fitase utilizada, em velocidades e ordem diferentes. Na conformação energética mais favorável do fitato (Figura 3), cinco dos grupos fosfatos estão em posição equatorial, enquanto o outro está em posição axial. As fitases fúngicas e de E. coli conseguem liberar somente cinco dos seis grupos (somente aqueles que estão em posição equatorial), sendo que os produtos finais são mio-inositol 2-monofosfato (WYSS et al., 1999). Figura 3: Conformação energética mais favorável do ácido fítico. Fonte: WYSS et al., 1999. O acompanhamento da retirada dos fosfatos foi estudado por Mitchell et al. (2008). Observou-se que a retirada dos grupos fosfatos das posições equatoriais acontecia rapidamente, enquanto a hidrólise do grupo axial acontecia tão lentamente que a conversão total do fitato a mio-inositol monofosfato estava completa antes do aparecimento do mio-inositol livre (Figura 4). A especificidade da enzima pelos intermediários da reação também muda, como mostra a Figura 4. Fez-se a comparação da especificidade com relação a primeira reação, portanto, a primeira reação aparece no gráfico como especificidade 1. Observa-se que a enzima apresenta uma maior especificidade por IP5 e ela vai diminuindo para as outras formas (MITCHELL et al., 2008). Figura 4- Acompanhamento da formação de produtos (esquerda) e especificidade da fitase de várias fontes (A-F) pelos intermediários (direita) Legenda: 1- IP6, 2- IP5, 3- IP4, 4- IP3, 5- IP2, Q- IP1 Fonte: Mitchell et al., 2008. Com base nas propriedades bioquímicas Oh et al. (2004) dividiu as fitases em duas classes. A primeira delas é a fitase de histidina ácida que contém os grupos diretamente à enzima para diminuir sua atividade, mas sim através da interação dos íons com o fitato, que assim não consegue se ligar fortemente a enzima. Em algumas fitases, o detergente EDTA pode aumentar a atividade, enquanto em outras como a phyC Bacillus subtilis que necessitam íons metálicos como Ca2+, o EDTA diminui a atividade (WYSS et al., 1999). 2. FONTES 2.1. Vegetal A fitase já foi encontrada em várias fontes vegetais, como trigo, milho, algumas ervas como faba, arbustos como mung, alfaces, centeio e sementes oleaginosas, sendo que a atividade mais alta foi encontrada no trigo, no centeio e na cevada. As fitases obtidas de sementes em germinação e polém têm sido purificadas e caracterizadas. Fitase alcalina também tem sido identificada no pólem de Lilium longiflorum, Typha latifólia e em sementes de legumes (ROOPESH, K et al.). Aos vegetais, geralmente, atribuem-se baixos valores de fitase, mas Jongbloed e Kemme (1990) e apud COLE (1991) demonstraram que a fitase do trigo pode melhorar a digestibilidade do fósforo de 27 para 50%. No entanto, para que se extraia a enzima de fontes vegetais em alta produção, é necessário um longo tempo para a germinação e um processo de extração em vários estádios, usando materiais perigosos, como hexano (NEWMAN, 1991). Ademais, KORNEGAY (1996) demonstrou que a fitase do trigo atua em um limite de pH bem menor do que a fitase fúngica e ressaltou algumas vantagens da fitase fúngica sobre a de origem vegetal, como a de ter atividade conhecida e ser estável. (FIREMAN, A. K. B. A. T. et al., 1998.) A tabela a seguir aponta as concentrações de P em várias fontes vegetais, sua porção disponível para utilização pelo ser vivo, e sua atividade. FONTE: (SELLE, P. H.; RAVINDRAN, V., 2008) Fonte vegetal Total de P (g.kg-1) P na forma de fitato (g.kg-1) Proporção (%) Bioavaliabilidade (%) Atividade da fitase (FTU kg-1) Cereais Cevada 3,21 1,96 61,0 30 348 Milho 2, 62 1,88 71,6 12 – 14 25 Sorgo 3,01 2,18 72,6 20 35 Trigo 3,07 2,19 71,6 49 503 Óleos vegetais Óleo de Canola 9,72 6,45 66,4 21 5 Óleo de Algodão 10,02 7,72 77,1 1 11 Óleo de Soja 6,49 3,88 59,9 23 – 31 42 Derivados Falero de Arroz 17,82 14,17 79,5 25 129 Farelo de Trigo 10,96 8,36 76,3 41 2173 A biotecnologia de plantas tem permitido a expressão de genes microbianos, geralmente bacterianos e fúngicos, em plantas de fácil cultivo, como o arroz. Como vantagem, perde-se a necessidade de utilizar biorreatores complexos ou grandes quantidades de energia obtida de combustíveis fósseis. Isso fez com que as plantas voltassem a ter destaque na produção de fitase. (HAMADA, A. et al., 2006) Maiores detalhes dessa tecnologia serão discutidos na seção de Inovações Tecnológicas. 2.2. Animal A atividade da fitase já foi descrita em diferentes fontes animais, como fígado de bezerro por Mc Collum & Hart em 1908, intestino de ratos por Patwardhan em 1937, intestino delgado de mamíferos por Cooper & Gowing em 1983, eritrócitos de galinhas por Martin & Luque em 1985 e mucosa intestinal de ratos por Yan et al em 1991. (ROOPESH, K et al) Também foi encontrado no sangue de aves, répteis, peixes e tartarugas marinhas em 1941 por Rapoport et al. Assim como as fontes vegetais, apresenta alguns problemas, principalmente uma produção instável e com determinação enzimática complicada, além de uma produção em média escala e cara. Uma utilização de fonte animal será discutida na seção de Inovações Tecnológicas. 2.3. Microbiana Apesar das fontes animais e vegetais representarem avanços científicos importantes, sua aplicação prática é limitada. Em compensação, fontes microbianas apresentam características que permitem um alto rendimento e ampliação de escala, tornando-se amplamente utilizadas de maneira efetiva na indústria de rações animais. (KIM, T., 2006) Várias espécies de fungos, bactérias e leveduras tem sido utilizadas na produção de fitases, geneticamente modificadas ou não, como mostrado na tabela abaixo. thermophile produzem, segundo relatos de Berka et al. 1998 e Ghosh 1997, fitase a 65°C e 45°C respectivamente (ROOPESH, K et al). A fitase de Aspergillus fumigatus é caracterizada como termo-resistente, mantendo 90% da sua atividade inicial após ser aquecida a 100°C por 20 minutos. Em comparação, a fitase de Aspergillus niger PhyA possui muito menos resistência térmica, apesar se uma atividade específica maior e melhor perfil de pH. Interessantemente, essas duas fitases apresentam homologia em 66% de suas seqüências, além de estruturas cristalinas muito semelhantes (ZHANG, W. et al., 2007). A tabela abaixo consiste em parte de um estudo comparativo feito por Wyss et al., em 1998, onde foram comparadas as atividades específicas da fitase de alguns fungos e de E. coli, bem como alguns de seus valores de Km. FONTE: WYSS, M. et al., 1999 Fitase Atividade específica (U/mg) Km (µM) Fitase de A. niger 102.5 < 5 Fitase de A. terreus 9A1 141.6 10.6 Fitase de A. terreus CBS 195.8 23.2 Fitase de A. fumigatus expressa em A. niger 26.5 ≤ 10 Fitase de A. fumigatus expressa em H. polymorpha 28.1 N.D Fitase de A. fumigatus expressa em S. cerevisiae 23.4 N.D Fitase de E. nidulans expressa em A. Niger 28.6 N.M.M Fitase de E. nidulans expressa em H. polymorpha 33.1 N.D Fitase de M. thermophila 41.8 - Fitase de E. coli 811.2 N.D N.M.M significa que não segue o comportamento de Michaelis-Menten N.D significa que não foi determinado 2.3.2. Bactéria Poucas espécies selvagens de bactérias são utilizadas para produção de fitase, principalmente devido ao baixo rendimento e por apresentarem uma faixa ótima de pH não adequada ao sistema digestivo dos monogástricos. Por isso, a busca concentra-se mais nas bactérias termo-ácidas-tolerantes. A atividade de fitases podem ser intra ou extracelular. Quando estudada em Enterobacter sp. 4, 81,7% foi detectada na fração extracelular, 4,4% na fração periplasmática, e o restante na porção intracelular (ROOPESH, K et al). Várias cepas bacterianas, geneticamente modificadas ou não, como Lactobacillus amylovorus, E. coli, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Klebsiella sp., etc., têm sido empregada para síntese de fitase. Sreeramulu et al. (1996) descobriu 19 cepas bactérias acido-láticas do gênero Lactobacillus e Streptococcus produtoras de fitase extra-celular. Várias delas exibiam atividade enzimática no meio fermentado, mas Lactobacillus amylovorus B4552 produziu a maior quantidade de fitase, variando entre 125±146 unidades/ml em SmF usando glucose e fosfato inorgânico. Essas descobertas ganharam importância considerando que L. amylovorus tem grande potencial em melhorar as qualidades nutricionais de cereais e alimentos fermentados. Uma espécie bacteriana que produz fitase extracelular foi isolada do solo próxima a raízes de leguminosas e identificada como Enterobacter sp 4. Sunitha et al. (1999) otimizou o meio de cultivo para a fitase recombinante de E. coli BL21, obtendo a mais alta atividade de atividade, de 2250 U/l. Uma modificação de B. subtilis produziu fitase celular com atividade de fitase extracelular de 2,0 unidades/ml, a qual constituía mais de 90% da proteína total produzida. O rendimento foi 100 vezes maior quando comparado com a espécie selvagem de B. amyloliquefaciens DS11. A utilização de Bacillus sp. KHU-10 produziu o mais alto nível de fitase extracelular, de 0,2 unidades/ml após quatro dias de fermentação em condições ótimas e com maltose como substrato, segundo Choi et al., 1999 (PANDEY, A, 2001). 2.3.3. Levedura A produção de fitase por leveduras é geralmente feita em sistemas SmF. As cepas produtoras incluem Schwanniomyces castellii, S. occidentalis, Hansenula polymorpha, Arxula adeninivorans, Rhodotorula gracilis, Pichia spartinae, P. rhodanensis, P. anomala (PANDEY, A, 2001, ROOPESH, K et al). Em cultivo contínuo usando cepas de S. castellii, a produção de fitase melhorou com aumento de pH e taxa de diluição, e decaiu quando a concentração de ácido fítico ou fosfato aumentou. Mayer et al. (1999) desenvolveu um sistema eficiente e de baixo custo para produção de fitase com Hansenula polymorpha. Glucose ou xarope de glucose foi utilizado como fonte principal de carbono durante a fermentação, reduzindo em 80% os custos quando comparado à utilização de glicerol. Além disso, altas concentrações da enzima ativa (até 13.5 g/l) foram encontradas no meio, onde a fitase representava mais de 97% do total protéico acumulado. Esses níveis de concentração ultrapassam de longe qualquer outro sistema de produção de fitase por leveduras até então desenvolvido (PANDEY, A, 2001). 3. PRODUÇÃO 3.1. MÉTODOS DE PRODUÇÃO 3.1.1. A partir de fontes microbinas Embora fitases possam ser obtidas de várias fontes como descrito anteriormente, a necessidade comercial para a indústria de alimentação animal é geralmente encontrada pela produção através de fontes microbianas. Ambas as fermentações, a submersa (SmF) como a de estado sólido (SSF), têm sido empregadas para a produção de fitase. A natureza dos substratos, a disponibilidade dos nutrientes, o tipos da linhagem, as condições de cultivo são fatores críticos que afetam o rendimento e devem ser considerados criticamente para a seleção de uma técnica particular. As condições de cultura e o genótipo da linhagem podem afetar a taxa de transferência de massa. A maioria dos estudos de fermentação submersa tem empregado as linhagens de Aspergillus sp. Como organismos produtores, principalmente o A. ficcum. Outras linhagens utilizadas são Mucor sp. e Rhizopus sp. Geralmente resíduos agro-industriais têm sido utilizados como substrato, como canola, bagaço de coco, farelo de trigo, e outros. Dependendo da natureza do substrato, a umidade inicial de substrato pode estar entre 53-64%. A suplementação do meio, com fontes de carbono adicionais, como glucose em baixas concentrações (6g/L) e surfactantes como Na-oleato ou Tween 80, pode ser útil para a síntese enzimática. A linhagem de M. racemosus forneceu o maior rendimento (14,51 IU/g de atividade de fitase em matéria seca) em bagaço de coco. A produção de fitase foi aumentada para 26 IU/g em matéria seca quando o bagaço de coco foi suplementado com glucose, caseína e sulfato de amônio. padrão simuladas e as sementes puderam ser armazenadas por pelo menos 1 ano sem perder a atividade (PEN et al., 1993). Em ensaios de alimentação, fitases foram recombinantemente produzidas em sementes de canola e soja tendo a mesma performance que as fitases microbianas (DENBOW et al., 1998; ZHANG et al., 2000). No entanto, a tolerância térmica da fitase de A. niger não seria suficiente para suportar o calor encontrado na produção de farelo de soja. Na abordagem de GUTKNECHT (1997), a planta de alfafa foi utilizada como um biorreator e não valorizada como um alimento animal. A maioria das fitases produzidas transgenicamente foi contida no suco coletado após o processamento da alfafa. Nenhuma fitase fúngica foi produzida em plantas. Os genes de fitase de E. coli (appA) e da bactéria ruminal Selenomonas ruminantium (SrPf6) foram expressas em sementes de arroz germinadas. A atividade da fitase atingiu 1,4 U.mg-1 da proteína celular extraída, que representou 60 vezes a atividade dos não transformados, sem qualquer efeito adverso no desenvolvimento da planta (HONG et al., 2004). A expressão de fitase do B. subtilis no citoplasma de tabaco ainda aumentou o número de flores e frutos. (YIP et al., 2003). Plantas transgênicas ou não serão usadas para a produção de fitases comerciais no futuro, seja para a alimentação ou como biorreator, dependerá dos custos de produção e aceitação pública da biotecnologia verde. (HAEFNER, S. et al., 2005) 3.2. PURIFICAÇÃO Genericamente fitases são purificadas por precipitação com solventes ou sais, seguida de cromatografia, como a de troca iônica e a de gel filtração. Ultrafiltração poderia também ser usada em combinação com a cromatografia. A fitase extracelular de B. subtilis (natto) N-7 foi purificada 322 vezes para homogeneidade por ultrafiltração e uma combinação de colunas cromatográficas sephadex G-100 e DEAE – Sepharose CL – 6B (SHIMIZU, 1992). A fitase extracelular de Bacillus sp. DS11 foi purificada para homogeneidade por precipitação por acetona e colunas cromatográficas fenil-sepharose e Superose 12 (KIM et al., 1998). A fitase de E. coli foi purificada usando precipitação por sulfato de amônio (25 a 80% de saturação), seguida por cromatografia em CM-sepharose CL6B, DEAE-sepharose CL6B, fenil sepharose CL4B e MonoS HR, 5/5 (GREINER et al., 1993). GOLOVAN et al. (2000) purificou a fitase de E. coli, a qual foi mais separada por chromatofocusing em duas isoformas de tamanhos idênticos com pontos isoelétricos de 6,5 e 6,3. TAMBE et al. (1994) purificou fitase de K. aerogenes usando cromatografia de troca iônica em DE- 52 seguida de gel filtração em coluna sephadex G-200. Outra fitase de Klebsiella oxytoca MO-3 foi purificada 400 vezes e parcialmente caracterizada. NAGASHIMA et al. (1999) purificou a fitase de A. niger SK-57 para homogeneidade em quatro passos, usando cromatografia de troca iônica (2 passos), gel filtração e chromatofocusing. SDS-PAGE dessa amostra purificada mostrou uma única banda de massa molecular de aproximadamente 60 kDa. Uma fosfatase ácida foi purificada de A. ficum NRRL 3135 por gel filtração e cromatografia de dextran troca iônica (IRVING et al., 1974). PASAMONES et al. (1997) concentrou a fitase de A. fumigatus super-expressa em A. niger NW205 aproximadamente 50 vezes por ultrafiltração seguida por cromatografia de troca iônica. Fracionamento por acetona (60%, v/v), gel filtração em G-100, seguida de cromatografia de DEAE-celulose foi a técnica utilizada por WANG et al. (1980) para a purificação de fitase de A. oryzae NRRL 1998. GHARIEB (1990) purificou com sucesso a fitase de A. carneus 43 vezes de culturas filtradas por precipitação por acetona, gel filtração através de sephadex G-75 e cromatografia de troca iônica em DEAE-celulose. Uma fitase parcialmente purificada foi obtida de A. adeninivorans por filtração em sephadex G50 e/ou cromatografia DEAE (SANO et al., 1999). Um método de purificação de três estágios incluindo cromatografia aniônica e de gel filtração foi utilizada para concentrar a fitase de S. castelli (SEGUEILHA et al., 1992; LAMBRECHTS et al., 1993). Uma fitase de Cândida krusei Wz-001 foi purificada para homogeneidade eletroforética por cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e gel filtração. Colunas Superdex 75pg e fenil Sepharose HP foram utilizadas para isso (QUAN et al., 2002). (ROOPESH, K et al.) 3.3. EXPRESSÃO HETERÓLOGA A fim de se obter processos de grande produção com menor custo vêm se aplicando técnicas de DNA recombinante. Mesmo que na prática a obtenção desse DNA recombinante não seja tão fácil quanto parece, rendimentos satisfatórios de proteínas recombinantes são alcançados. O fragmento de DNA (1,4 kbp) contendo o gene de produção da fitase foi inserido no vetor de expressão pPICZalpha A e expressa em Pichia pastoris, que resulta em altos níveis de expressão de fitase extracelular (RODRIGUEZ et al. 2000). De forma parecida, o gene da fitase de A. niger (phyA) foi expressa em S. cerevisiae. Nesse caso, o vetor de expressão utilizado foi pYES2. A fitase expressa tinha massa molecular de 120kDa devido a glicosilações, além de apresentar termoestabilidade. O gene phyA de A. niger var awamorri ALKO243 foi clonada e seqüenciada e a sua re-introdução resultou numa superprodução de fitase (PIDDINGTON et al. 1993). Gist-Brocades clonou múltiplas cópias de A. niger NRRL 3135 phy A em seu PluGBug system, produzindo altos níveis de fitase, e passou a comercializar o produto como Natuphos® (VAN DIJCK 1999). A Novo Nordisk está produzindo uma fitase comercial sob o nome de Bioffed phytase®. Este produto é resultado da clonagem do gene codificante de fitase de Peniophora lycii (um basidiomiceto) e sendo superexpressado em A. niger. O gene phyA do fungo termofílico Thermomyces lanuginosus foi inserido em um vetor de expressão com controle transcripcional do promotor do gene codificante de tripsina de Fusarium oxysporum e o produto recombinante obtido retém sua atividade em 75°C. O gene codificante de fitase phyC foi clonado da biblioteca genômica de B. subtilis VTT E-68013 e o seu seqüenciamento não demonstrou qualquer homologia com as fitases ou fosfatases conhecidas, apesar de exibir atividade de fitase (KEROVUO et al. 1998). O gene codificante de fitase de Bacillus sp. DS11 foi clonado em E. coli e a massa molecular da proteína recombinante foi estimada em 41,80 kDa, segundo KIM et al. 1998. Novos conceitos na biotecnologia de plantas usando engenharia de plantas transgênicas para produção de enzimas em escala industrial têm sido aplicados na produção de fitases. O gene phyA de A. ficuum (441 aminoácidos) foi expressa em folhas de Nicotiana tabacum. A temperatura ótima da proteína recombinante permaneceu a mesma enquanto o pH ótimo foi alterado de 5 para 4. ULLAH et al, em 2002, clonou o gene da fitase de A. ficcum e expressou em plantas “alfa-alfa”. A enzima expressa foi purificada, e exibiu todas as propriedades da enzima fúngica. O gene da fitase de A. niger NRRL 3135 tem sido expressa na soja, mas a fitase recombinante tem menor massa molecular em relação à enzima nativa fúngica. Tem-se buscado a clonagem e expressão de fitases fúngicas em animais. O gene codificante de fitase appA de E. coli foi clonado em camundongos e regulado para expressão nas glândulas salivares. A fitase salivar dos camundongos transgênicos reduziu o fósforo fecal em 11% (GOLOVANT et al. 2001). (ROOPESH, K et al.)