Docsity
Docsity

Prepare-se para as provas
Prepare-se para as provas

Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity


Ganhe pontos para baixar
Ganhe pontos para baixar

Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium


Guias e Dicas
Guias e Dicas

Isolamento de microrganismos, Notas de estudo de Biotecnologia

Isolamento de microrgnismos e culturas puras.

Tipologia: Notas de estudo

Antes de 2010

Compartilhado em 18/10/2009

bmtt-n-10
bmtt-n-10 🇧🇷

4.7

(9)

10 documentos

Pré-visualização parcial do texto

Baixe Isolamento de microrganismos e outras Notas de estudo em PDF para Biotecnologia, somente na Docsity! UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS Trabalho acadêmico apresentado à disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paraná. CURITIBA 2008 1 SUMÁRIO 1- INTRODUÇÃO................................................................................................ 2 1.1- MEIOS DE CULTURA.............................................................................. 5 2- DIVERSIDADE MICROBIANA........................................................................ 7 3- ISOLAMENTO EM CULTIVO SÓLIDO........................................................... 13 3.1- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS........................................... 13 3.2- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO............................. 14 3.3- TÉCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO........................... 16 3.4- TÉCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE................................ 17 4- ISOLAMENTO EM CULTIVO LÍQUIDO......................................................... 17 5- ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTÍNUO..................................................... 18 6- CULTURAS PURAS DE BACTÉRIAS........................................................... 21 7- CULTURAS PURAS DE ACTINOMICETOS.................................................. 21 8- CULTURAS PURAS DE FUNGOS................................................................. 23 9- CULTURAS PURAS DE ALGAS.................................................................... 23 10- OUTRAS TÉCNICAS.................................................................................... 23 11- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 25 12- ANEXOS....................................................................................................... 27 4 Tabela 1 – Principais centros de coleção de culturas Fonte: ROITMAM, TRAVASSOS e AZEVEDO, 1988. O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provável de conter o microrganismo desejado, podendo variar desde solo até águas, ar, lodo, alimentos ou órgãos. Características que um determinado organismo possui para se 5 desenvolver em certo ambiente são usadas como fatores seletivos no processo de isolamento. Pressão seletiva é muitas vezes utilizada no isolamento de microrganismos que se desenvolvem preferencialmente em determinado substrato, na presença de certos compostos ou no cultivo sob condições que são adversas a outros microrganismos que não são de interesse. Quando não é possível fazer uso da pressão seletiva, utilizam-se características detectáveis como morfologia (tipo e forma da colônia) ou produção de compostos característicos de determinada espécie (como, por exemplo, a produção de antibióticos por estreptomicetos) (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995). 1.1- MEIOS DE CULTURA Para fazer o isolamento de um microrganismo, deve-se empregar o meio de cultivo mais adequado para o seu desenvolvimento. O meio de cultura é um material nutriente preparado em laboratório cuja utilização é importante para o crescimento, transporte e estocagem de microrganismos. No preparo do meio muitas vezes emprega-se o ambiente natural como modelo de composição, pois os requerimentos nutricionais dos microrganismos refletem o tipo de ambiente onde ele é encontrado (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). Os meios de cultivo podem ser classificados em: meios sintéticos (quimicamente definidos) e meios complexos. Os meios sintéticos são aqueles em que a composição química exata é conhecida. Alguns microrganismos necessitam de um meio definido com muitos fatores necessário para o crescimento e são denominados fastidiosos ou muito exigentes em termos nutricionais. Meios quimicamente definidos são utilizados normalmente em trabalhos experimentais em laboratórios ou para o crescimento de seres autotróficos (TORTORA et al., 2006). Já os meios complexos são aqueles que apresentam algum componente que tem uma composição variável. Nesse caso estão incluídos extratos de leveduras, de carne, de plantas ou produtos da digestão protéica como peptonas. Quando o meio complexo está na forma líquida é chamado de caldo nutriente e quando está na forma solidificada é chamado de ágar nutriente. Esses meios são utilizados normalmente para bactérias heterotróficas e fungos (TORTORA et al., 2006). Meios complexos também são usados quando não as necessidades nutricionais de um 6 microrganismo em particular não são conhecidas e, portanto, um meio definido não pode ser construído (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). No caso de microrganismos anaeróbios deve-se utilizar um meio especial denominado meio redutor. Eles contêm reagentes como o tioglicolato de sódio que é capaz de se combinar com o oxigênio dissolvido, eliminando-o da cultura (TORTORA et al., 2006). Meios de cultivo que propiciam o desenvolvimento de vários tipos de microrganismos são chamados de meios de uso geral, como o tryptic soy broth. Quando esses meios são complementados com algumas substâncias de forma a fortificá-lo, temos então um meio enriquecido. Quando há substâncias que favorecem o crescimento de determinado organismo e/ou inibem o de outros no meio, eles passam a serem chamados de meios seletivos. Nesses meios há componentes como sais de bile e cristal violeta (inibem o desenvolvimento de bactérias gram-positivas), substratos degradados somente por alguns tipos de microrganismos, ou antibióticos (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). Os meios de cultivo também podem ser diferenciais quando é possível distinguir de alguma forma os diferentes tipos de microrganismos. Por exemplo, no ágar sangue é possível separar bactérias hemolíticas (que formam um halo ao seu redor) de não-hemolíticas (que não formam halo), ou no ágar MRS com corante azul de anilina, onde as bactérias lácteas irão ficar azuladas e outros microrganismos não. Também existem os meios de enriquecimento, que são utilizados no isolamento de bactérias presentes em pequeno número junto com outras que estão em grande quantidade. Ele é semelhante ao meio seletivo, sendo que a diferença é que o microrganismo a ser cultivado está em pequena quantidade e seu crescimento deve ser estimulado (TORTORA et al., 2006). A tabela 2 resume todos esses meio e em que ocasiões eles devem ser utilizados. 9 A figura 3 mostra as diferentes combinações dessas características e a classificação dos microrganismos com relação a elas. Figura 3- Classificação de microrganismos de acordo com as fontes utilizadas Fonte: OGUNSEITAN, 2005. Meios de cultivo seletivo ou condições seletivas de incubação podem ser usados para estreitar a variedade de espécies em uma comunidade microbiana. O uso de meios enriquecidos com determinado substrato limitante possibilita um maior crescimento de determinadas espécies em detrimento de outras. Por exemplo, Beijerinck isolou espécies de Rhizobium de nódulos de raízes através do enriquecimento por substratos nitrogenados limitantes; estudos recentes usando enriquecimento também conseguiram descobrir espécies capazes de metabolizar moléculas xenobióticas e antropogênicas de poluentes. A técnica de enriquecimento também pode ser chamada na literatura de bioaugmentation ou molecular breeding (OGUNSEITAN, 2005). As interações entre microrganismos no ambiente podem ser muito importantes, e, quando não se deseja utilizar somente um microrganismo isolado, pode-se fazer uso de dois tipos de culturas: culturas de populações mistas ou culturas de comunidades microbianas. A primeira consiste na combinação de duas 10 ou mais culturas puras enquanto exclui outros microrganismos, pois é feito em condições assépticas. Culturas de comunidades microbianas já incluem interações entre fatores bióticos e abióticos, podem ocorrer variações da composição das espécies microbianas devido a essas condições. Elas são mantidas em microcosmos que são estruturados para incubar amostras naturais em laboratório, sendo importantes na investigação de como mudanças ambientais tem reflexo na diversidade microbiana. (OGUNSEITAN, 2005) Há uma grande diversidade de populações microbianas, sendo que em cada ambiente será encontrado um nicho diferente. Pequenas distâncias como milímetros no solo podem ter uma condição de oxigênio, luz e nutrientes diferente que propicia o desenvolvimento de variados microrganismos. A tabela 3 mostra a quantidade de microrganismos estimada no solo dependendo da profundidade estudada. Esse número não é certo, pois não é possível isolar em uma placa para contagem todos os tipos de microrganismos presentes na natureza (TORTORA et al., 2006). Tabela 3- Microrganismos por grama de um solo típico de jardim em várias profundidades. Profundidade (cm) Bactérias Actinomicetos* Fungos Algas** 3-8 9.750.000 2.080.000 119.000 25.000 20-25 2.179.000 245.000 50.000 5.000 35-40 570.000 49.000 14.000 500 65-75 11.000 5.000 6.000 100 135-145 1.400 - 3.000 - * Bactérias filamentosas ** Algas encontradas em grandes profundidades não são ativas metabolicamente, mas foram introduzidas por drenagem ou movimentos mecânicos. Fonte: TORTORA et al., 2006. Além dos solos, também podem ser isolados microrganismos do ambiente aéreo, aquático. No ambiente aquático, as populações microbianas são afetadas principalmente pela disponibilidade de oxigênio, nutrientes e luminosidade. Para algas fotossintéticas a luz é a fonte de energia principal e, portanto, elas se localizam próximas à superfície. Esses organismos são importantes para o ambiente porque também são fontes de alimento para bactérias, protozoários, peixes e outras 11 formas de vida aquática. Como o oxigênio não se difunde bem na água, perto do fundo de um lago estarão microrganismos anaeróbicos. A Figura 4 mostra um lago em três zonas de características diferentes e os microrganismos mais prováveis de serem encontrados em cada uma (TORTORA et al., 2006). Figura 4- As zonas de um lago e os microrganismos típicos de cada zona Fonte: TORTORA et al., 2006. Podemos ver também a variação dos tipos de microrganismos encontrados de acordo com cada porção de um ambiente através da coluna de Winogradsky (Figura 5). Ela consiste de uma coluna de 30 cm de altura por 5 cm de diâmetro onde há a deposição de um terço do volume com sedimento de rio ou lago e a complementação com água do mesmo ambiente. É então feito o cultivo por dois a três meses e, após esse período é possível isolar microrganismos devido ao gradiente químico. Será possível encontrar microrganismos representantes de cada uma das categorias apresentadas anteriormente na Figura 3. (OGUNSEITAN, 2005) 14 figura 6, onde são feitas estrias na porção 1 da placa e em seguida flamba-se a alça; após, faz-se uma retirada de bactérias da região 1 e espalha-se sobre a região 2; flamba-se mais uma vez e espalha-se bactérias da região 2 na 3. As colônias presentes na região 3 estarão mais isoladas (TORTORA et al., 2006). Fazendo de forma contínua, haveria primeiramente a coleta de uma pequena quantidade do meio de semeadura e iniciar-se-ia as estrias em uma das bordas da placa e percorreria o fio de platina continuamente na forma de estrias até a outra borda da placa (DROVAL, LIMA, HABU, 2001). LECLERC e colaboradores (1983) descrevem a semeadura por estrias feita em duplicata em uma mesma placa, percorrendo a alça ou fio de platina somente até o centro da placa, e do lado oposto fazendo o mesmo procedimento. As colônias isoladas estarão mais ao centro e, através da repetição, poder-se-ia obter microrganismos que estavam presentes na segunda amostra do inóculo, porém não presente na primeira. Figura 6- Semeadura por estrias com alça de platina Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002; TORTORA et al., 2006. 3.2- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO Nessa técnica, que é mostrada na figura 7, um pequeno volume da solução de microrganismos contendo de 30-300 células é transferido para o cento de uma 15 placa de ágar já solidificado com o auxílio de uma pipeta estéril. Em seguida, mergulha-se uma alça de Drigalski em álcool e a flamba de modo a manter todo o material estéril. Com o auxílio dessa alça, espalha-se aquele volume depositado por toda a superfície do ágar. As colônias cresceram espalhadas por toda a superfície do ágar. (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002) Figura 7- Semeadura por espalhamento Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002. O espalhamento pode ser feito também empregando outros materiais. GREENE e colaboradores testaram a utilização do aparato mostrado na figura 8, que consiste de um anel cilíndrico metálico com uma tira de material fibroso. Ao botar em contato o material fibroso e a amostra de inóculo líquida, por exemplo, os microrganismos irão se fixar na fibra e estão carimba-se meios de cultivo estéreis sucessivamente, de modo a obter colônias cada vez mais isoladas e definidas. Figura 8- Aparato para semeadura do meio Fonte: GREENE, VERSLEY e KEENAN, 1962. 16 3.3- TÉCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO O método de semeadura por derramamento, ou também denominado de pour plate é muito utilizado para bactérias e fungos. A amostra original é diluída de forma que quando é feita a placa consegue-se colônias bem separadas. Um pequeno volume da melhor diluição é então derramado em uma placa de Petri sem ágar. Em seguida, derrama-se ágar fundido na temperatura de 45ºC e mistura-se os dois com uma agitação leve da placa e deixa-se o meio solidificar. Figura 9- Comparação entre o método de pour plate e de espalhamento Fonte: TORTORA et al., 2006. 19 No entanto, nem sempre o organismo com maior taxa de crescimento é o desejável, mas sim aquele que apresenta uma maior afinidade pelo substrato limitante. Para isso, faz-se uso de um cultivo contínuo, onde novo meio de cultivo é adicionado de tempos em tempos e as pressões seletivas são restauradas (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995). Em um cultivo contínuo, a taxa de crescimento depende da taxa de diluição e da concentração do substrato limitante. Para definir isso, deve-se partir da equação de Monod, mostrada na fórmula 1: (1) onde μ é a taxa de crescimento , s é a concentração do substrato residual, Ks é a constante de utilização do substrato (que expressa a afinidade do microrganismo para o consumo do substrato). No estado estacionário, temos que μ é igual a taxa de diluição (D), transformando a fórmula em: (2) onde é a concentração do substrato no reator, que será constante no estado estacionário. Como mostrado pela fórmula 2, se o substrato estiver abaixo do nível da taxa de crescimento predita pela taxa de diluição, pode ocorrer que a taxa de crescimento será menor que a taxa de diluição e as células serão eluídas do reator (wash out) numa taxa maior do que a taxa de sua produção, resultando na diminuição na concentração de biomassa desse microrganismo (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995). Como exemplo genérico de um processo de isolamento usando cultivo contínuo temos a Figura 12, em que temos dois microrganismos em cultivo contínuo, onde, se a taxa de diluição for menor do que a do ponto Y, o organismo B se desenvolverá mais, mas quando a taxa de diluição é maior, temos o organismo A se desenvolvendo preferencialmente. Portanto, o cultivo será limitado pelo substrato, podendo ser obtidos microrganismos que não seriam detectados durante o cultivo em batelada. Os organismos obtidos através do cultivo em batelada ou em placas de Petri podem muitas vezes não se adaptar ao cultivo contínuo, sendo mais vantajoso fazer 20 o isolamento diretamente através do cultivo contínuo para selecionar aqueles já adaptados para essa condição quando deseja-se desenvolver um processo em sistema contínuo. Figura 1- Efeito da concentração do substrato na taxa de crescimento de dois microrganismos. Fonte: STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995. Essa técnica é bastante utilizada na seleção de microrganismos para a produção de biomassa, mas também já foi usada para o isolamento de bactérias produtoras de enzimas (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995). 21 6- CULTURAS PURAS DE BACTÉRIAS Ao fazer o isolamento das culturas, não só de bactérias, mas também de outros microrganismos, deve-se fazer uma coleta de material ambiental com instrumentos estéreis. Bactérias existem em grande variedade na natureza, e cada tipo necessita de um meio de isolamento diferente. Algumas necessitam ágar suplementado com extratos na concentração de 10 a 50% do volume total, outras necessitam de infusões feitas do material da onde foram coletadas (solo, lama, folhas, pedras, troncos, detritos). Podem ser usados também alguns meios seletivos como ágar sangue, verde bile brilhante, MRS, ou McConkey (DEMAIN and DAVIES, 1999). 7- CULTURAS PURAS DE ACTINOMICETOS Actinomicetos são bactérias filamentosas que fazem parte da maioria dos substratos naturais. Não é difícil isolar actinomicetos de amostras que também contém fungos devido às suas propriedades fisiológicas distintas. O uso de antibióticos e antifúngicos também auxilia no isolamento, como mostra a tabela 4. Tabela 4- Antibióticos usados e microrganismos alvo que são inibidos Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995. Os actinomicetos geralmente crescem lentamente, e demoram de 4 a 20 dias para formarem colônias definidas quando incubadas à temperatura de 65-80ºC (DEMAIN and DAVIES, 1999). O crescimento desses microrganismos também é favorecido quando há no meio de cultivo algum dos componentes listados na tabela 5: 24  A clonagem de genes codificantes para enzimas ou receptores usados na detecção de microrganismos pode fazer com que eles estejam mais acessíveis em grande escala para a realização dos testes.  O uso de genes repórteres, que codificam substâncias facilmente detectáveis e que são fusionados com uma seqüência que produz a substância de interesse.  Sondas moleculares para seqüências de genes particulares podem detectar microrganismos capazes de produzir certos produtos.  O desenvolvimento de testes imunológicos como a captura por ELISA. (STANBURY, WHITAKER e HALL, 1995) Com relação a esse último, a técnica de imunocaptura pode ser utilizada no isolamento de bactérias. SANTOS e REIS (artigo em anexo 1) utilizaram essa metodologia para isolar Gluconacetobacter diazotropicus e de bactérias fixadoras de nitrogênio proveniente do solo. Para o isolamento de G. diazotropicus fez-se uso de anticorpos anti-Gluconacetobacter diazotropicus fixados em uma microplaca de poliestireno de 96 poços, onde é colocada a amostra de solo. Após as etapas de incubação e lavagem, a ligação da bactéria com o anticorpo foi quebrada com a adição de KCl 0,1M. A desvantagem dessa técnica é que é necessário o conhecimento prévio do microrganismo que se deseja isolar e deve-se fazer o inóculo de suas células mortas em cobaias como coelhos para a produção de anticorpos. As técnicas de micromanipulação também podem ser utilizadas para o isolamento, apesar de serem mais caras devido aos equipamentos. Com o uso de objetivas de longa distância com uma grande magnificação, é possível coletar uma única célula microbiana através de tubos microcapilares, que irão aspirar a bactéria e depois depositá-la em uma outra superfície de ágar ou em um meio líquido (para mais, ver artigo em anexo 2). Existe também a possibilidade de utilizar a citometria de fluxo para separar células de microrganismos. Essa técnica utiliza anticorpos marcados, sondas de nucleotídeos marcadas fluorescentemente ou constituentes celulares que naturalmente refratam a luz ou emitem fluorescência. A Tabela 1 presente no anexo 3, mostra propriedades de certos microrganismos que podem ser diferenciadas através da citometria de fluxo, podendo-se então isolar essas células. 25 11- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DEMAIN, A.L.; DAVIES, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Second Edition, ASM Press, Washington, D.C.,1999, 830p. DROVAL, A. A.; LIMA, D. P.; HABU, S. Manual Prático de Microbiologia de Alimentos. Curso de Microbiologia de Alimentos, Manual do Participante. CEFET/PR – Unidade de Medianeira, 2001. EL-NAKEEB, M. A.; LECHEVALIER, H. A. Selective isolation of aerobic actinomycetes. Appl. Microbiol., Vol. 11, p. 75-77, 1963. FRÖHLICH, J.; KÖNIG, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews, 24, p. 567-572, 2000. GREENE, V. W.; VERSLEY, D.; KEENAN, K. M. New Method for Microbiological Sampling of Surfaces. J. Bacteriol., Vol. 84, p.188-189, 1962. KATSURAGI, T.; TANI, Y. Screening for Microorganisms with Specific Characteristics by Flow Cytometry and single-Cell Sorting. Journal of bioscience and Bioengineering, Vol. 89, No. 3, p. 217-222, 2000. LECLERC, H.; IZARD, D.; HUSSON, M.-O.; WATTRE, P.; JAKUBCZAK, E. Microbiologie Générale. Doin Éditeurs, Paris, 1983. 369 p. OGUNSEITAN, O. Microbial Diversity – Form and Function in Prokaryotes. Blackwell Publishing, Oxford, 2005, 292 p. PRESCOTT, L. M.; HARLEY, J. P.; KLEIN, D. A. Microbiology. 5th edition. The McGraw-Hill Companies, 2002, 1139 p. ROITMAM, I.; TRAVASSOS, L. R.; AZEVEDO, J. L. Tratado de Microbiologia – Volume 1. Editora Manole Ltda., São Paulo, 1988, 186p. 26 SANTOS, C. C. R.; REIS, V. M. Desenvolvimento do Método de Imunocaptura de Bactérias para Aplicação em Solo Argiloso. EMBRAPA, Comunicado Técnico 64, ISSN 1517-8862, Março 2004, Seropédica, RJ. STANBURY, P. F.; WHITAKER, A.; HALL, S. J. Principles of Fermentation Technology. Second Edition. Butterworth Heinemann, Elsevier Science, 1995, 357 p. TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, A. L. Microbiologia. 8ª edição, 1ª reimpressão, Artmed, Porto Alegre, 2006, 894 p.
Docsity logo



Copyright © 2024 Ladybird Srl - Via Leonardo da Vinci 16, 10126, Torino, Italy - VAT 10816460017 - All rights reserved