Isolamento de microrganismos

Isolamento de microrganismos

(Parte 1 de 3)

Trabalho acadêmico apresentado à disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paraná.

CURITIBA 2008

1- INTRODUÇÃO2
1.1- MEIOS DE CULTURA5
2- DIVERSIDADE MICROBIANA7
3- ISOLAMENTO EM CULTIVO SÓLIDO13
3.1- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS13
3.2- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO14
3.3- TÉCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO16
3.4- TÉCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE17
4- ISOLAMENTO EM CULTIVO LÍQUIDO17
5- ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTÍNUO18
6- CULTURAS PURAS DE BACTÉRIAS21
7- CULTURAS PURAS DE ACTINOMICETOS21
8- CULTURAS PURAS DE FUNGOS23
9- CULTURAS PURAS DE ALGAS23
10- OUTRAS TÉCNICAS23
1- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS25

1- INTRODUÇÃO

Isolamento consiste na obtenção de culturas puras que envolvem somente o organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleção de uma colônia através da observação da produção de determinado produto ou da morfologia da colônia (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

Apesar de existir a possibilidade de utilizar microrganismos geneticamente modificados, ainda é possível encontrar uma grande variedade de novos microrganismos no meio ambiente, sendo que muitos podem ser até comercialmente interessantes. A primeira etapa para a utilização de um microrganismo de interesse industrial muitas vezes é a etapa de isolamento de uma colônia.

Normalmente, as colônias de microrganismos se originam somente de uma célula ou esporo de microrganismo. Essas colônias apresentam características morfológicas diferentes, as quais permitem a distinção entre os microrganismos, como mostra a Figura 1. No entanto, para conseguir uma visualização das colônias independentes no meio sólido, é necessário a distribuição uniforme das bactérias sobre a placa de Petri. (TORTORA et al., 2006)

Figura 1- Morfologia de colônias bacterianas

Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.

Uma cultura livre de outros microrganismos contaminantes onde o microrganismo de interesse está presente de forma homogênea é denominada cultura axênica. Um cultivo desse tipo dá oportunidade de investigação de características fisiológicas e genéticas sem a interferência de outros microrganismos e em uma densidade populacional muito maior do que a encontrada em amostras de meio ambiente. No entanto alguns fatores podem ser alterados justamente por esse motivo, pois no meio ambiente ocorre uma interação entre diversas espécies e nutrientes, podendo, por exemplo, modificar o formato, a textura e a coloração de colônias (OGUNSEITAN, 2005).

O isolamento, assim como todo o processo que irá se desenvolver futuramente, deve ser o mais econômico possível, levando-se em consideração a produtividade que será obtida pelo microrganismo e os gastos necessários para isolamento de tal microrganismo. Fatores importantes na escolha de um microrganismo são as suas características nutricionais, pois se almeja obter microrganismos que utilizem substratos baratos, que podem ser obtidos através da formulação adequada do meio de isolamento; a temperatura ótima, pois organismos com temperatura ótima de 40ºC para cima facilitam o isolamento e reduz os custos de resfriamento do fermentador; ser compatível com o fermentador utilizado e com o processo de cultivo desejado; e deve ser geneticamente estável, ou quando se deseja a manipulação genética devem ser conhecidos os melhores mecanismos (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

Os microrganismos isolados podem ser obtidos a partir de ambientes naturais ou a partir de bancos de cepas. Esses centros de cepas, como os mostrados na Tabela 1, podem fornecer microrganismos de características já conhecidas, mas nem sempre estão presentes os melhores caracteres desejados, enquanto o ambiente possui uma infinidade de variações. Os bancos de culturas têm como função o armazenamento, a prevenção de eventuais mudanças nas suas características, o ensino e a pesquisa sobre manutenção e caracterização de cepas (ROITMAM, TRAVASSOS e AZEVEDO, 1988).

Pode ser mais barato comprar uma cultura do que isolá-la da natureza, mas também pode ser que se encontre um organismo muito melhor depois de uma procura extensa no meio ambiente. Mas geralmente é necessário utilizar uma cepa dos bancos como uma referência para comparação com novos microrganismos descobertos através do isolamento da natureza (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

4 Tabela 1 – Principais centros de coleção de culturas

Fonte: ROITMAM, TRAVASSOS e AZEVEDO, 1988.

O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provável de conter o microrganismo desejado, podendo variar desde solo até águas, ar, lodo, alimentos ou órgãos. Características que um determinado organismo possui para se desenvolver em certo ambiente são usadas como fatores seletivos no processo de isolamento.

Pressão seletiva é muitas vezes utilizada no isolamento de microrganismos que se desenvolvem preferencialmente em determinado substrato, na presença de certos compostos ou no cultivo sob condições que são adversas a outros microrganismos que não são de interesse.

Quando não é possível fazer uso da pressão seletiva, utilizam-se características detectáveis como morfologia (tipo e forma da colônia) ou produção de compostos característicos de determinada espécie (como, por exemplo, a produção de antibióticos por estreptomicetos) (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

1.1- MEIOS DE CULTURA

Para fazer o isolamento de um microrganismo, deve-se empregar o meio de cultivo mais adequado para o seu desenvolvimento. O meio de cultura é um material nutriente preparado em laboratório cuja utilização é importante para o crescimento, transporte e estocagem de microrganismos. No preparo do meio muitas vezes emprega-se o ambiente natural como modelo de composição, pois os requerimentos nutricionais dos microrganismos refletem o tipo de ambiente onde ele é encontrado (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).

Os meios de cultivo podem ser classificados em: meios sintéticos (quimicamente definidos) e meios complexos. Os meios sintéticos são aqueles em que a composição química exata é conhecida. Alguns microrganismos necessitam de um meio definido com muitos fatores necessário para o crescimento e são denominados fastidiosos ou muito exigentes em termos nutricionais. Meios quimicamente definidos são utilizados normalmente em trabalhos experimentais em laboratórios ou para o crescimento de seres autotróficos (TORTORA et al., 2006).

Já os meios complexos são aqueles que apresentam algum componente que tem uma composição variável. Nesse caso estão incluídos extratos de leveduras, de carne, de plantas ou produtos da digestão protéica como peptonas. Quando o meio complexo está na forma líquida é chamado de caldo nutriente e quando está na forma solidificada é chamado de ágar nutriente. Esses meios são utilizados normalmente para bactérias heterotróficas e fungos (TORTORA et al., 2006). Meios complexos também são usados quando não as necessidades nutricionais de um microrganismo em particular não são conhecidas e, portanto, um meio definido não pode ser construído (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).

No caso de microrganismos anaeróbios deve-se utilizar um meio especial denominado meio redutor. Eles contêm reagentes como o tioglicolato de sódio que é capaz de se combinar com o oxigênio dissolvido, eliminando-o da cultura (TORTORA et al., 2006).

Meios de cultivo que propiciam o desenvolvimento de vários tipos de microrganismos são chamados de meios de uso geral, como o tryptic soy broth. Quando esses meios são complementados com algumas substâncias de forma a fortificá-lo, temos então um meio enriquecido.

Quando há substâncias que favorecem o crescimento de determinado organismo e/ou inibem o de outros no meio, eles passam a serem chamados de meios seletivos. Nesses meios há componentes como sais de bile e cristal violeta (inibem o desenvolvimento de bactérias gram-positivas), substratos degradados somente por alguns tipos de microrganismos, ou antibióticos (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).

Os meios de cultivo também podem ser diferenciais quando é possível distinguir de alguma forma os diferentes tipos de microrganismos. Por exemplo, no ágar sangue é possível separar bactérias hemolíticas (que formam um halo ao seu redor) de não-hemolíticas (que não formam halo), ou no ágar MRS com corante azul de anilina, onde as bactérias lácteas irão ficar azuladas e outros microrganismos não.

Também existem os meios de enriquecimento, que são utilizados no isolamento de bactérias presentes em pequeno número junto com outras que estão em grande quantidade. Ele é semelhante ao meio seletivo, sendo que a diferença é que o microrganismo a ser cultivado está em pequena quantidade e seu crescimento deve ser estimulado (TORTORA et al., 2006). A tabela 2 resume todos esses meio e em que ocasiões eles devem ser utilizados.

Tabela 2- Meios de Cultura Tipo Finalidade

Quimicamente definido

Crescimento de quimioautotróficos e autotróficos e análises microbiológicas.

Complexo Crescimento da maioria dos organismos quimio-heterotróficos. Redutor Crescimento de anaeróbios obrigatórios.

Seletivo Impedir o crescimento de microrganismos não desejados; favorecer o crescimento do organismo de interesse.

Diferencial Diferenciar colônias do organismo de interesse dos outros microrganismos.

Enriquecimento Semelhante ao seletivo, mas com a característica importante de aumentar o número de bactérias de interesse tornando-a detectável.

Fonte: TORTORA et al., 2006.

2- DIVERSIDADE MICROBIANA

O termo diversidade, no contexto biológico, define a multiplicidade de formas presente em um sistema, sendo que muitas vezes essas diferentes formas só ficam aparentes através da utilização de ferramentas especializadas de observação. Essas ferramentas podem ir desde a visualização através de microscópio ou até uma análise em nível molecular.

No entanto, mesmo com toda a tecnologia disponível, não é possível obter uma informação completa sobre todos os microrganismos presentes em uma amostra de ambiente, devido à inadequação de certos microrganismos às técnicas de recuperação, isolamento e cultivo utilizadas atualmente. Esses microrganismos não cultiváveis ainda são metabolicamente ativos e são chamados de “viáveis, mas não cultiváveis” (VBNC – viable but non-culturable) ou de somnicélulas ou “dormentes não-esporuladas”. Portanto, muitos microrganismos presentes na natureza ainda não formaram colônias viáveis sob condições laboratoriais e somente 10% (ou menos) é passível de ser cultivado em laboratório. A figura 2 esquematiza os microrganismos possíveis de serem cultivados (ativos, danificados e dormentes) e aqueles não-cultiváveis (VBNC, inativas, e mortas) (OGUNSEITAN, 2005).

8 Figura 2- Estados fisiológicos dos microrganismos e possibilidade de cultivo

Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

Para os organismos cultiváveis, ainda pode haver uma diferença na sua atividade na natureza e sob condições laboratoriais. Por exemplo, as cianobactérias Trichodesminium são capazes de formar colônias em laboratório, mas na natureza são encontradas somente na forma individualizada.

A maioria das tentativas de isolamento tenta proporcionar uma condição balanceada de nutrientes como fonte de carbono, condições ótimas de temperatura, pH, pressão de oxigênio e umidade. Algumas espécies requerem também fatores de crescimento, sendo que alguns deles podem estar sendo produzidos por outras espécies que convivem junto no meio ambiente. A simulação de um ambiente natural é um bom começo para o isolamento e cultivo desses microrganismos. (OGUNSEITAN, 2005)

Devido à grande diversidade de microrganismos presentes no meio ambiente, é possível encontrar numa amostra ambiental características nutricionais variadas, as quais definem o tipo de meio de isolamento a ser utilizado. Pode-se fazer uma distinção com relação às fontes de energia, fontes de carbono e os oligoelementos.

A figura 3 mostra as diferentes combinações dessas características e a classificação dos microrganismos com relação a elas.

Figura 3- Classificação de microrganismos de acordo com as fontes utilizadas

Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

Meios de cultivo seletivo ou condições seletivas de incubação podem ser usados para estreitar a variedade de espécies em uma comunidade microbiana. O uso de meios enriquecidos com determinado substrato limitante possibilita um maior crescimento de determinadas espécies em detrimento de outras. Por exemplo, Beijerinck isolou espécies de Rhizobium de nódulos de raízes através do enriquecimento por substratos nitrogenados limitantes; estudos recentes usando enriquecimento também conseguiram descobrir espécies capazes de metabolizar moléculas xenobióticas e antropogênicas de poluentes. A técnica de enriquecimento também pode ser chamada na literatura de bioaugmentation ou molecular breeding (OGUNSEITAN, 2005).

As interações entre microrganismos no ambiente podem ser muito importantes, e, quando não se deseja utilizar somente um microrganismo isolado, pode-se fazer uso de dois tipos de culturas: culturas de populações mistas ou culturas de comunidades microbianas. A primeira consiste na combinação de duas ou mais culturas puras enquanto exclui outros microrganismos, pois é feito em condições assépticas. Culturas de comunidades microbianas já incluem interações entre fatores bióticos e abióticos, podem ocorrer variações da composição das espécies microbianas devido a essas condições. Elas são mantidas em microcosmos que são estruturados para incubar amostras naturais em laboratório, sendo importantes na investigação de como mudanças ambientais tem reflexo na diversidade microbiana. (OGUNSEITAN, 2005)

Há uma grande diversidade de populações microbianas, sendo que em cada ambiente será encontrado um nicho diferente. Pequenas distâncias como milímetros no solo podem ter uma condição de oxigênio, luz e nutrientes diferente que propicia o desenvolvimento de variados microrganismos. A tabela 3 mostra a quantidade de microrganismos estimada no solo dependendo da profundidade estudada. Esse número não é certo, pois não é possível isolar em uma placa para contagem todos os tipos de microrganismos presentes na natureza (TORTORA et al., 2006).

Tabela 3- Microrganismos por grama de um solo típico de jardim em várias profundidades.

* Bactérias filamentosas ** Algas encontradas em grandes profundidades não são ativas metabolicamente, mas foram introduzidas por drenagem ou movimentos mecânicos.

Fonte: TORTORA et al., 2006.

Além dos solos, também podem ser isolados microrganismos do ambiente aéreo, aquático. No ambiente aquático, as populações microbianas são afetadas principalmente pela disponibilidade de oxigênio, nutrientes e luminosidade. Para algas fotossintéticas a luz é a fonte de energia principal e, portanto, elas se localizam próximas à superfície. Esses organismos são importantes para o ambiente porque também são fontes de alimento para bactérias, protozoários, peixes e outras formas de vida aquática. Como o oxigênio não se difunde bem na água, perto do fundo de um lago estarão microrganismos anaeróbicos. A Figura 4 mostra um lago em três zonas de características diferentes e os microrganismos mais prováveis de serem encontrados em cada uma (TORTORA et al., 2006).

Figura 4- As zonas de um lago e os microrganismos típicos de cada zona

Fonte: TORTORA et al., 2006.

Podemos ver também a variação dos tipos de microrganismos encontrados de acordo com cada porção de um ambiente através da coluna de Winogradsky (Figura 5). Ela consiste de uma coluna de 30 cm de altura por 5 cm de diâmetro onde há a deposição de um terço do volume com sedimento de rio ou lago e a complementação com água do mesmo ambiente. É então feito o cultivo por dois a três meses e, após esse período é possível isolar microrganismos devido ao gradiente químico. Será possível encontrar microrganismos representantes de cada uma das categorias apresentadas anteriormente na Figura 3. (OGUNSEITAN, 2005)

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