Melhoramento de microrganismos de interesse industrial

Melhoramento de microrganismos de interesse industrial

(Parte 1 de 5)

Trabalho acadêmico apresentado à disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paraná.

CURITIBA 2008

1- INTRODUÇÃO2
2- GENÉTICA MICROBIANA3
2.1- BACTÉRIAS4
2.2- FUNGOS8
3- MUTAÇÃO12
3.1- MUTAÇÃO ESPONTÂNEA13
3.2- MUTAÇÃO INDUZIDA14
3.2.1- Agentes físicos15
3.2.2- Agentes químicos17
3.3- MECANISMOS DE REPARO21
3.4- SOBREVIVÊNCIA E SELEÇÃO DE MUTANTES23
4- TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE24
4.1- PROBLEMAS24
4.2- VETORES27
4.3- PRODUÇÃO E DETECÇÃO DE CLONES RECOMBINANTES29
4.4- REGULAMENTAÇÃO SOBRE OGM32
5- EXEMPLOS DE MICRORGANISMOS MELHORADOS37
6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS38

1- INTRODUÇÃO

A utilização de um microrganismo em um processo biotecnológico envolve geralmente a produção de algum composto de interesse. No entanto, as espécies que são encontradas na natureza normalmente não produzem grandes quantidades de metabólitos, somente o necessário para a sobrevivência. Por isso, cabe ao biotecnologista melhorar essa produção para poder aplicá-la em escala industrial.

Para atingir esse objetivo, podem-se utilizar dois métodos. O primeiro seria definido como a biotecnologia convencional, ou seja, a otimização das condições fisiológicas e nutricionais do meio de cultivo onde o microrganismo cresce. Essa técnica pode apresentar bons resultados, mas às vezes não é suficiente, pois há a limitação da capacidade máxima de síntese do microrganismo.

Poucas indústrias utilizam cepas silvestres nos seus processos de produção.

A produção de mutantes mais adaptados para processos é uma busca constante na pesquisa de melhoramento de microrganismos. Isso se deve principalmente ao valor econômico de aumento da produção, chegando às vezes até a 100 vezes mais. Processos que envolvem produtos oriundos de um ou poucos genes, como a produção de enzimas, podem ser incrementados somente com o aumento da dose gênica, ou seja, aumento da quantidade do mesmo gene presente na célula e aumento do seu nível de expressão. Já para metabólitos secundários, o processo de melhoramento já é mais complicado, pois, como são produtos finais de vias biossintéticas, envolve várias etapas reacionais, e a modificação delas é mais trabalhosa.

Algumas vezes o objetivo desejado não é o melhoramento do produto, mas sim a capacidade de desenvolvimento do microrganismo em determinadas condições ambientais. Pode-se melhorar cepas de forma a obter microrganismos que necessitam tempos de fermentação mais curtos, que não produzam metabólitos indesejáveis (barateando o custo de recuperação do produto), que necessitam de menos oxigênio ou que são capazes de utilizar determinados substratos como resíduos agroindustriais.

A manipulação genética pode ser muito utilizada pela biotecnologia, pois é uma ferramenta muito útil para aumentar o rendimento da produção, melhorar a qualidade do processo de produção, melhorar as características do produto (como na melhoria de enzimas conferindo maior especificidade e termoestabilidade), produzir produtos já existentes por outras vias alternativas, e produtos novos produtos não encontrados na natureza.

A modificação do material genético pode ser feita de duas formas: ação de agentes mutagênicos ou a produção de DNA recombinante. A mutagênese de microrganismos permite a criação de genótipos diferentes da célula original através da alteração aleatória dos genes. Já a recombinação permite um rearranjo de genes que permite a inserção de material genético de várias fontes em um só microrganismo. A mudança química no DNA, independente de ser por mutagênese ou recombinação, é um fator necessário, mas muitas vezes insuficiente para a produção de um mutante, pois antes de se observar uma população de células modificadas capazes de passar o novo material genético para as futuras gerações é necessário lidar com os mecanismos de reparo da célula, a transcrição e tradução da informação, e também o enriquecimento do meio de cultura com os mutantes desejados.

Mutações favoráveis para a produção de determinado produto muitas vezes podem acarretar na modificação das necessidades ambientais da célula. Portanto, após a seleção de um mutante é necessário determinar os novos parâmetros de cultivo necessários para o melhor aproveitamento das potencialidades do microrganismo através da biotecnologia básica. Ao mesmo tempo pode-se tentar melhorar ainda mais a cepa mutante através do outras mutações, ou seja, o processo de melhoramento de uma cepa envolve a modificação genética contínua da cultura e determinação dos novos parâmetros operacionais.

Esse trabalho visa mostrar em mais detalhes a utilização de técnicas de melhoramento genético de cepas de microrganismos. Para ilustrar melhor esses princípios, estão em anexo dois artigo mostrando a aplicação dos conceitos.

2- GENÉTICA MICROBIANA

A genética microbiana começou a ser elucidada com Fred Griffith em 1928, quando se observou a transferência da virulência de cepas de Streptococcus pneumoniae. Ele percebeu que quando uma cepa não virulenta da bactéria entrava em contato com constituintes da célula inativada de uma cepa virulenta, havia a transformação da cepa não-virulenta, e esta passava também a causar a doença. Oswald T. Avery foi quem descobriu que a cepa se transformava devido à incorporação de material genético da bactéria inativada, provando que o DNA carregava a informação genética.

Em 1952, Alfred D. Hershey e Martha Chase mostraram que o DNA é o material genético de bacteriófagos T2. Eles utilizaram fósforo radioativo para observar se era o material do DNA que penetrava na célula bacteriana e transferia as informações do fago.

Após esses estudos, vários outros foram feitos, o que contribuiu muito para o desenvolvimento da biologia molecular, propiciando a obtenção de organismos mutantes e de recombinantes.

2.1- BACTÉRIAS

A principal fonte de material genético nas bactérias é o cromossomo bacteriano, que consiste um uma dupla fita de DNA geralmente circular e contém todos os genes essenciais para a sobrevivência em condições normais. As bases nucléicas podem apresentar ou não algumas metilações que servem para identificar material genético velho durante a replicação, proteger o DNA da ação de nucleases, e cronometrar certos eventos celulares.

A maioria dos genes presentes no cromossomo das bactérias apresenta uma única cópia, exceto os genes que codificam para RNA ribossomal. Aproximadamente 90% do DNA presente codifica para proteínas e polipetídeos, e os 10% servem para o controle da expressão gênica. Não há a presença de DNA sem função aparente como acontece nas células eucarióticas.

Uma parte do DNA bacteriano está organizada na forma de operons, ou unidades transcricionais, que apresentam seqüências codificadoras para produtos correlatos e mesmo sítio de regulação, como mostra a Figura 1. As seqüências ativadoras e repressoras controlam a síntese e a freqüência da transcrição.

5 Figura 1- Transcrição e tradução de um operon

Fonte: Ratledge & Kristiansen, 2006.

Além do cromossomo, a bactéria pode apresentar outros tipos de fontes de informações genéticas, como mostra a Tabela 1. Os plasmídeos são elementos circulares de DNA extra-cromossômico que geralmente contém gene de resistência a algum antibiótico. Os transpossons são seqüências de DNA capazes de se movimentar de uma região para outra no genoma de uma célula. Já os profagos são seqüências gênicas provenientes de bacteriófagos e foram incorporadas no cromossomo da bactéria.

Tabela 1- Tamanho médio dos elementos genéticos encontrados em bactéria

Fonte: Ratledge & Kristiansen, 2006.

Para entender como modificar geneticamente uma bactéria, primeiramente é necessário conhecer os mecanismos de transferência do material genético. O mais essencial é a transferência do DNA para as células filhas durante a divisão celular. Para isso ocorre uma duplicação do DNA circular a partir da origem de replicação oriC. Na forquilha de replicação formada, a duplicação ocorre nas duas direções ao mesmo tempo (Figura 2, esquerda). Como a replicação em bactérias ocorre muito rapidamente e muitas vezes inicia-se uma replicação sem que a anterior tenha terminado, acontece a formação de inúmeras cópias durante a divisão, como mostra a Figura 1 à direita. O cromossomo bacteriano está aderido a uma invaginação da membrana celular chamada mesossomo, e esse fato é importante para que a cópia formada após a replicação vá para a célula filha.

Figura 2- Replicação bacteriana

Fonte: Ratledge & Kristiansen, 2006.

Outro processo de transferência de material genético é a conjugação, que consiste na transferência de DNA plasmidial diretamente de uma célula doadora de material genético para uma célula receptora desse material através de uma fímbria. O plasmídeo possui uma região codificante para a fímbria. Logo, as células doadoras foram chamadas de células F+, e o receptor F-. Existem também as células que têm plasmídeo ligado ao cromossoma bacteriano, são as chamadas de Hfr (High Frequency of Recombination) e são elas que transferem genes cromossômicos de células doadoras para células receptoras. Na natureza a conjugação dá-se entre espécies e, raramente ocorrem cruzamentos inespecíficos entre gêneros aparentados, como Escherichia e Shigella.

O processo de transformação é aquele que foi observado por Griffit em 1928 durante o experimento com pneumococos. O fenômeno foi chamado de transformação, pois não requer um contato entre duas células, mas sim a incorporação de um DNA exógeno no cromossomo da bactéria e que sa pareia numa região homóloga do cromossomo da mesma. Há a formação de recombinantes nas próximas duplicações, pois, o seguimento incorporado vai também sofrer duplicação. Desta forma, pode haver modificação em uma ou mais características genéticas de células descendentes.

A transformação é um ótimo sistema genético para estudos. Por meio dela pode-se combinar genes de diferentes linhagens em uma mesma, fazer mapeamento genético e construir mapas bastante detalhados de regiões do genoma das espécies estudadas. A descoberta da transformação em outros organismos, como fungos filamentosos e leveduras e a utilização em larga escala do mecanismo de tecnologia do DNA recombinante, faz com que esse sistema de recombinação tenha grande importância econômica e biotecnológica.

O último processo seria a transdução, que é uma outra forma alternativa de recombinação usando bacteriófagos. Pode também ser considerado um refinado processo de transformação. Foi descrito pela primeira vez em 1952 na bactéria Salmonella typhimurium. Nesse caso, os fagos infectam as bactérias, lisam-na e podem ter um seguimento do DNA bacteriano substituído pelo seu próprio DNA, ou mesmo ter alguns genes da bactéria inserido no seu próprio genoma. Assim, ao infectar uma outra célula e injetar nela seu material genético, é desencadeado a transdução.

Existem basicamente três tipos distintos de transdução: a generalizada (ocorre quando uma célula, depois de infectada é lisada e um ou poucos fagos contém no interior de sua capa protéica DNA da bactéria, não impedindo que o fago alterado infecte outra bactéria), a específica (ocorre com um tipo de fago de ciclo lisogênico -fago λ- que não lisa a célula, mas picota o seu material genético e o encapsula como se fosse seu), e a abortiva (quando o fago vetor carreia penetra na célula bacteriana receptora mas, por razões ainda não conhecidas, não é integrado ao cromossomo bacteriano e, não tendo duplicação autônoma, também não se duplica dentro dela).

Assim como a conjugação e a transformação, a transdução também pode ser usada para mapeamento de genes ao longo do cromossomo. Uma co-transdução, isto é, duas características freqüentemente sendo transduzidas, indicam ligação de genes.

A transferência do material genético nos fungos pode ocorrer de forma sexuada ou assexuada. A reprodução assexuada pode ser feita na forma de divisão binária da célula parental em duas células filhas, por brotamento (principalmente em leveduras), e pela produção de esporos assexuados. Os esporos assexuais podem ser formados por:

Fragmentação da hifa formando células que se comportam com esporos, chamadas artroconidia ou artroesporos.

Envolvimento da célula por uma espessa parede antes da separação, formando clamidoesporos.

Formação de esporos dentro de um saco na ponta ponta da hifa, gerando esporangioesporos.

Formação de esporos fora de um saco nos lados ou ponta da hifa, chamados conidioesporos.

Produção de esporos durante o processo de brotamento, chamados blastoesporos.

Alguns fungos que apresentam compatibilidade nucléica têm reprodução sexuada. Fungos haplóides sofrem fusão das hifas e formação de uma célula dicariótica, onde há dois núcleos haplóides separados. Em seguida ocorre a da fusão nuclear (cariogamia). Isso produz um estágio diplóide, o zigoesporo, que sofrerá várias meioses e processos de recombinação para gerar esporos com combinações dos genótipos parentais.

Nos fungos existe também a reprodução parassexual, que pode ocorrer tanto em espécies que fazem reprodução sexuada como assexuada. Na reprodução parassexual há a fusão de hifas de igual ou diferente número de núcleos, formando um micélio heterocarioto de com núcleos de ambas as cepas parentais. O heterocarioto é normalmente estável pode ocorrer também a fusão dos núcleos. Para se obter recombinação dos genes é necessário produzir células haplóides ou esporos. A haploidização nesse caso pode ser induzida com a utilização de pfluorofenilalanina. A formação dos haplóides não acontece devido à meiose, mas devido à distribuição aleatória dos cromossomos às células filhas (Figura 3).

Figura 3- Ciclo parassexual

Fonte: < http://www2.mcdaniel.edu/Biology/botf99/fungifromweb/fungiintro.html >

O melhoramento genético de fungos de importância industrial aconteceu primeiramente através de técnicas genéticas clássicas, a qual buscava espécies naturais com as melhores qualidades e cruzava-se essas linhagens para obter uma nova cepa melhorada. Após, surgiu também outras tecnologias de mutação, fusão de protoplastos e do DNA recombinante, as quais permitiram uma maior manipulação genética dos fungos, resultando em novas características de valor biotecnológico adicionadas às espécies. A Figura 4 mostra o aumento do rendimento na produção de penicilina utilizando mutação das cepas.

Figura 4- Melhoramento genético para a produção de penicilina pelo fungo filamentoso Penicillium chrysogenum

Fonte: < http://www.ufv.br/dbg/trab2002/MELHOR/MHR004.htm >

A fusão de protoplastos é usada geralmente em leveduras e bolores.

Protoplastos são células desprovidas de parede celular que podem ser obtidas em laboratório e que permitem uma maior manipulação. A formação dos protoplastos é realizada crescendo células em uma solução isotônica contendo estabilizadores osmóticos (como a sacarose) para evitar o rompimento da membrana e tratando as células com enzimas que degradam a parede celular. Após a remoção da parede, a fusão de protoplastos pode ser então realizada através da adição de agentes fusogênicos como polietilenoglicol (PEG). Além do PEG, pode ser utilizado o processo de fusão induzida por campo elétrico. Quando as células se encontram em um campo elétrico de corrente alternada aparecem orifícios na membrana plasmática, os quais facilitam o processo de fusão celular. Os protoplastos fusionados não necessariamente são da mesma espécie, e essa é uma das vantagens da técnica. Por exemplo, protoplastos de Penicillium roquefortii podem ser fusionados com protoplastos de P. chrysogenum, e protoplastos de leveduras podem ser fusionados até com eritrócitos.

MARTINS, HORII e PIZZIRANI-KLEINER (1998) estudaram a fusão de protoplastos da levedura Saccharomyces cerevisiae com o objetivo de obter linhagens de leveduras com características importantes na indústria vinícula. Primeiramente as células foram cultivadas em meio YEPD líquido e após crescimento foram lavadas várias vezes de forma a separar os pellets. Uma das alíquotas retiradas recebeu o tratamento da enzima lítica Novozym 234 e foi incubada à 28ºC.

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