Meios de cultivo em bioprocessos industriais

Meios de cultivo em bioprocessos industriais

(Parte 1 de 5)

Trabalho acadêmico apresentado à disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paraná.

CURITIBA 2008

1. INTRODUÇÃO2
2. NECESSIDADES NUTRICIONAIS DOS MICRORGANISMOS6
2.1. BACTÉRIAS E FUNGOS8
2.2. ALGAS12
2.3. PROTOZOÁRIOS13
2.4. CÉLULAS ANIMAIS E VEGETAIS14
3. COMPONENTES DO MEIO DE CULTIVO15
3.1. FONTES DE CARBONO15
3.1.1. Bagaço de mandioca17
3.1.2. Bagaço e melaço de cana19
3.1.3. Extrato de malte2
3.1.4. Melaço e vinhaça de soja24
3.1.5. Casca e polpa de café25
3.1.6. Resíduos de frutas28
3.2. FONTES DE NITROGÊNIO29
3.2.1. Extrato de levedura30
3.2.2. Peptonas31
3.2.3. Farelo de soja32
3.2.4. Resíduos de extração de óleos32
3.3. FONTES DE MINERAIS34
3.3.1. Vinhaça de cana36
3.4. SUBSTÂNCIAS QUELANTES36
3.5. FATORES DE CRESCIMENTO37
3.6. TAMPÕES38
3.7. ADIÇÃO DE PRECURSORES39
3.8. ADIÇÃO DE INIBIDORES39
3.9. ADIÇÃO DE INDUTORES39
4. DESIGN DE MEIOS DE CULTIVO40
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS42

SUMÁRIO 6. ANEXOS ............................................................................................................ 4

1. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento de um processo biotecnológico requer o cultivo de células microbianas em meio de cultivo adequado. Esse meio deve suprir todas as necessidades nutritivas do microrganismo para a síntese do material celular e a produção de metabólitos de interesse industrial.

Muitas vezes em escala laboratorial, utilizam-se meios de cultivo prontos vendidos comercialmente. Esses meios são materiais nutrientes geralmente sintéticos cuja utilização é importante para o crescimento, transporte e estocagem de microrganismos. No preparo do meio muitas vezes emprega-se o ambiente natural como modelo de composição, pois os requerimentos nutricionais dos microrganismos refletem o tipo de ambiente onde ele é encontrado (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).

Os meios de cultivo podem ser classificados em: meios sintéticos (quimicamente definidos) e meios complexos. Os meios sintéticos são aqueles em que a composição química exata é conhecida. Alguns microrganismos necessitam de um meio definido com muitos fatores necessário para o crescimento e são denominados fastidiosos ou muito exigentes em termos nutricionais. Meios quimicamente definidos são utilizados normalmente em trabalhos experimentais em laboratórios ou para o crescimento de seres autotróficos (TORTORA et al., 2006).

Já os meios complexos são aqueles que apresentam algum componente que tem uma composição variável. Nesse caso estão incluídos extratos de leveduras, de carne, de plantas ou produtos da digestão protéica como peptonas. Quando o meio complexo está na forma líquida é chamado de caldo nutriente e quando está na forma solidificada é chamado de ágar nutriente. Esses meios são utilizados normalmente para bactérias heterotróficas e fungos (TORTORA et al., 2006). Meios complexos também são usados quando não as necessidades nutricionais de um microrganismo em particular não são conhecidas e, portanto, um meio definido não pode ser construído (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).

No caso de microrganismos anaeróbios deve-se utilizar um meio especial denominado meio redutor. Eles contêm reagentes como o tioglicolato de sódio que é capaz de se combinar com o oxigênio dissolvido, eliminando-o da cultura (TORTORA et al., 2006).

Meios de cultivo que propiciam o desenvolvimento de vários tipos de microrganismos são chamados de meios de uso geral, como o tryptic soy broth. Quando esses meios são complementados com algumas substâncias de forma a fortificá-lo, temos então um meio enriquecido.

Quando há substâncias que favorecem o crescimento de determinado organismo e/ou inibem o de outros no meio, eles passam a serem chamados de meios seletivos. Nesses meios há componentes como sais de bile e cristal violeta (inibem o desenvolvimento de bactérias gram-positivas), substratos degradados somente por alguns tipos de microrganismos, ou antibióticos (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).

Os meios de cultivo também podem ser diferenciais quando é possível distinguir de alguma forma os diferentes tipos de microrganismos. Por exemplo, no ágar sangue é possível separar bactérias hemolíticas (que formam um halo ao seu redor) de não-hemolíticas (que não formam halo), ou no ágar MRS com corante azul de anilina, onde as bactérias lácteas irão ficar azuladas e outros microrganismos não.

Também existem os meios de enriquecimento, que são utilizados no isolamento de bactérias presentes em pequeno número junto com outras que estão em grande quantidade. Ele é semelhante ao meio seletivo, sendo que a diferença é que o microrganismo a ser cultivado está em pequena quantidade e seu crescimento deve ser estimulado (TORTORA et al., 2006). O tipo de meio selecionado para o cultivo dependerá da finalidade do cultura, como resume a Tabela 1.

No entanto, na indústria deseja-se baratear o processo de cultivo do microrganismo, e para que isso seja atingido, são realizados testes com outras fontes de carbono e nitrogênio. Muitos resíduos agroindustriais conseguem suprir de maneira satisfatória as necessidades nutricionais de alguns microrganismos e podem ser utilizados como um componente meio de cultivo de forma econômica. O seu uso também tem um papel ambiental, pois evita o desperdício de material aproveitável e a poluição da natureza por eles.

4 Tabela 1- Seleção de meios dependendo do objetivo do cultivo.

Os resíduos provenientes do processamento de materiais agrícolas fornecem grandes oportunidades econômicas para a biotecnologia. Entre esses resíduos estão o bagaço de mandioca, o bagaço de cana, a polpa e a casca de café, a polpa de frutas, o melaço, e o farelo de soja. Eles já são utilizados em muitos processos com sucesso, possibilitando a produção de etanol, enzimas, cogumelos, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabólitos secundários, bioativos, entre outros produtos (PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007). O artigo em ANEXO 1 mostra essa busca de fontes de nutrientes econômicas através da utilização de um dos resíduos mais abundantes na natureza, os resíduos celulósicos. Verificou-se a eficiência de crescimento dos fungos Aspergillus niger e Penicillium chrysogenum nesses meios alternativos, obtendo-se um bom crescimento em serragem e em polpa de cana-deaçúcar, mas em material somente com celulose teve-se um menor crescimento.

Para que seja atingido um bom rendimento na fermentação industrial utilizando resíduos agroindustriais, é necessário:

Ter um meio de cultivo equilibrado em nutrientes. Quando isso não ocorre somente com a adição do resíduo, deve-se suplementar o meio com outras fontes para atender a todas as necessidades fisiológicas da célula.

A composição do meio deve ser invariável. Lotes novos devem ser constantemente vistoriados para evitar mudanças, as quais ocorrem naturalmente dependo da origem do material, do tipo de processo pelo qual ele passou, entre outros.

Ele não deve interferir em grande parte na recuperação do produto, pois ao se economizar na matéria prima com meios complexos com várias impurezas, pode-se estar aumentando o custo nos processos downstream de purificação.

Não deve ocorrer repressão catabólica ou repressão por fosfato devido a componentes do resíduo. Para evitar isso se pode modificar a concentração de alguns nutrientes ou utilizar cepas mutantes que não sofrem repressão.

O material residual utilizado como substrato deve ser o mais econômico possível. Deve-se considerar se o material é facilmente disponível em quantidades suficientes sem altos custos de transporte.

O resíduo deve auxiliar o controle do processo (como o controle do pH) ou pelo menos não dificultá-lo.

O resíduo não deve precisar de tratamentos dispendiosos de preparo anteriores à fermentação, pois encarece o processo.

Os componentes do resíduo devem permitir algum tipo de armazenamento por um período de tempo. O problema encontra-se em substratos que apresentam grande atividade de água (aw), pois pode ocorrer contaminação da amostra mais facilmente.

O resíduo não deve causar grandes problemas no tratamento de efluentes para a empresa (CRUEGER & CRUEGER, 1993; STANBURY, WHITAKER & HALL, 1995).

2. NECESSIDADES NUTRICIONAIS DOS MICRORGANISMOS

Os componentes nutricionais do meio de cultivo dependerão do microrganismo que está sendo cultivado. Cada organismo possui vias metabólicas específicas para a obtenção de energia e produção de metabólitos, e elas devem ser respeitadas. Não somente a diversidade de tipos de microrganismos (bactérias, fungos, leveduras), mas também a variedade de espécies e cepas pode determinar especificidades com relação às necessidades nutricionais (VOGEL & TODARO, 1997). A Figura 1 apresenta a divisão dos microrganismos com relação à fonte de energia e de carbono utilizada.

Organismos fotoautótrofos são aqueles que absorvem energia luminosa e utilizam dióxido de carbono como fonte de carbono. Essa categoria inclui as plantas superiores, algas eucarióticas, algas azuis e verdes, e algumas bactérias fotossintéticas (como as bactérias sulfúricas roxas e verdes). Já organismos fotoheterótrofos absorvem energia na forma de luz, mas necessitam compostos orgânicos como fonte de carbono. Eles não conseguem utilizar dióxido de carbono como fonte primária e não produzem oxigênio. Nesse grupo estão bactérias fotossintéticas conhecidas como bactérias não-sulfúricas roxas e algumas algas eucarióticas (OGUNSEITAN, 2005; VOGEL & TODARO, 1997).

Os organismos fotossintéticos e os quimioautótrofos são os únicos reais produtores de matéria orgânica no planeta, e eles propiciam, diretamente ou indiretamente, as formas orgânicas de energia necessárias para os outros microrganismos (VOGEL & TODARO, 1997). Quimioautótrofos usam compostos químicos como doadores de elétrons para a produção de energia, mas eles dependem da molécula de CO2 para a produção de compostos com carbono presentes na biomassa. Esse grupo contém somente em bactérias que podem reduzir compostos nitrogenados (NH3, NO2), íons de ferro, compostos sulfúricos reduzidos (H2S, S, S2O3 2-), ou H2. Quimioheterótrofos utilizam compostos químicos para a produção de energia e compostos orgânicos para a biossíntese. Por exemplo, muitos organismos quimioheterótrofos utilizam a glucose tanto como fonte de energia como fonte de carbono. Eles também conseguem utilizar componentes mais complexos como lipídios, proteínas, carboidratos alifáticos insaturados, e compostos aromáticos para a produção de energia. Esse grupo compreende uma grande variedade de microrganismos, incluindo fungos e a maioria das bactérias (OGUNSEITAN, 2005; VOGEL & TODARO, 1997).

Figura 1- Classificação de microrganismos de acordo com as fontes utilizadas

Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

Como os quimioheterótrofos são a grande maioria e tem grande importância industrial, eles ainda podem ser divididos em organismos respiratórios, os quais fazes a oxidação de substratos orgânicos e a redução de um agente inorgânico oxidante que atua como aceptor de elétrons (usualmente o O2), e organismos fermentadores, os quais utilizam compostos orgânicos na reoxidação de NADH

Alguns organismos conhecidos como fastidiosos tem necessidades nutricionais complexas, e não é possível cultivá-los em meios quimicamente definidos. Como eles requerem muitos fatores de crescimento, é necessário usar meios complexos para que ocorra o crescimento. A utilização de extrato de levedura e outros resíduos agroindustriais pode suprir essas necessidades (OGUNSEITAN, 2005).

Além das fontes de energia e carbono, os microrganismos necessitam de fontes de outros elementos como nitrogênio, minerais, oligoelementos e fatores de crescimento, os quais são utilizados diferentes formas pela célula na formação de biomassa e produtos metabólicos. A seguir serão discutidas as necessidades nutricionais de alguns tipos de microrganismos de uma forma geral.

2.1. BACTÉRIAS E FUNGOS

Dos mais de 100 elementos presentes na tabela periódica, 35-40 são nutrientes essenciais para microrganismos. No entanto, os mais importantes são seis não-metais (C, H, O, N, P, S) e dois metais (K, Mg), compreendendo aproximadamente 98% do peso seco de bactérias e fungos. A maior parte das células (80-90%) é constituído de água, sendo esse outro fator importante para o desenvolvimento do microrganismo. Os nutrientes citados acima são chamados de macronutrientes, pois são utilizados em grande quantidade no cultivo de microrganismos (Tabela 2).

Tabela 2- Macronutrientes, função fisiológica e concentração média em meios de cultivo.

O carbono constitui aproximadamente 50% do peso seco de bactérias e fungos. Alguns microrganismos como as Pseudomonas spp. podem utilizar mais de

90 tipos de compostos orgânicos como única fonte de carbono e energia, enquanto outros, como bactérias metanogênicas, utilizam somente um número restrito de substratos.

O nitrogênio contabiliza de 8 a 14% do peso seco de bactérias e fungos.

Existe uma variedade de compostos orgânicos e inorgânicos que podem ser utilizados para suprir esse elemento em um meio de cultivo. Praticamente todas as bactérias e fungos conseguem metabolizar a amônia

(NH4+), pois é essa a forma na qual o nitrogênio é incorporado em compostos orgânicos da célula. Ele é adicionado no meio de cultivo na forma de sais como sulfato de amônio ((NH4)2SO4) e cloreto de amônio (NH4Cl). O problema dessa fonte encontra-se na diminuição do pH do meio durante a fermentação com íons amônio, pois o sistema de transporte do íon para dentro da célula envolve a antitransporte de íons hidrogênio para fora da célula (MOO-YOUNG, 1985).

Algumas bactérias conseguem utilizar o nitrogênio atmosférico (N2), fazendo sua fixação no solo na forma de nitritos e nitratos e auxiliando a captação desse nutriente pelas plantas. Organismos utilizados na produção de inoculantes agrícolas devem apresentar essa característica. Apesar de o crescimento durante a fixação de nitrogênio atmosférico ser lento devido às altas necessidades energéticas para o processo, tem-se grande interesse nessa área de estudo para bactérias azuis e verdes.

O nitrato também pode ser utilizado por muitos fungos filamentosos e algumas bactérias e leveduras. Algumas bactérias também conseguem utilizar os íons NO3- como aceptor final de elétrons. Muitos fungos filamentosos e bactérias também conseguem quebrar proteínas e peptídeos, sendo que este último também pode ser quebrado por leveduras (MOO-YOUNG, 1985).

O hidrogênio e o oxigênio necessários para o crescimento já está presente na maioria dos compostos orgânicos utilizados como fonte de carbono, e também em moléculas de água presente na célula. Algumas bactérias conseguem utilizar H2 gasoso como fonte de energia, como as bactérias metanogênicas. O oxigênio, diferente do hidrogênio, é necessário na forma de O2 para organismos aeróbicos. O fósforo é necessário para várias reações e tem um grande efeito na formação de metabólitos secundários. A forma mais utilizada é o fósforo inorgânico

(PO4 3-), sendo que soluções de fosfato também servem como tampões, auxiliando no controle do pH. Outra fonte de fósforo é materiais orgânicos como glicerofosfato.

O enxofre é melhor assimilado por fungos e bactérias na forma de sulfato inorgânico (SO4 2-). Ela pode ser obtida através da utilização de sais como o sulfato de amônio, o qual serve simultaneamente como fonte de enxofre e nitrogênio. As bactérias metanogênicas não conseguem utilizar os íons sulfato, e em alguns casos esse composto é um inibidor, sendo necessário utilizar a forma mais reduzida (S2-). No entanto o sulfeto é tóxico em altas concentrações e também causa a precipitação de vários íons metálicos, causando uma deficiência em metais traço (MOO-YOUNG, 1985).

O potássio é o cátion inorgânico mais presente no interior da célula, ligandose nos ribossomos de procariotos, sendo cofator de várias enzimas, e estando envolvido em vários sistemas de transporte. O magnésio é outro íon necessário para bactérias e fungos, pois seus ribossomos necessitam dessa molécula. Ele também atua como cofator enzimático e está presente em paredes e membranas celulares.

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