Apostila Mutagênese

Apostila Mutagênese

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO DISCIPLINA BMB163 - BIOFÍSICA PARA BIOLOGIA

Ana Beatriz Furlanetto Pacheco

Wanda M. Von Krüger Luis Carlos S. Ferreira

ÍNDICE Mutações – Conceito e introdução 2 Classificações das Mutações 3 A origem das mutações (mutações espontâneas e induzidas) 5

Mutações espontâneas 5 Mutações induzidas 10

Mutagênese mediada por elementos de transposição 13

O que são elementos de transposição 13 Tipos de mutação gerados por elementos de transposição 16

Aplicações experimentais da mutagênese 18

Como gerar e detectar mutantes em laboratório 18 Sistemas para detectar mutantes 18 Técnicas para gerar mutações 19

Mutagênese generalizada 19 Mutagênese sítio específica ou dirigida 20

Técnicas de mutação dirigida 21

Engenharia de proteínas 23

Alteração da estabilidade da proteína 23 Alteração da atividade enzimática 25

Bibliografia 26 Estudos dirigidos 27

Mutações – Conceito e introdução Mutações são alterações hereditárias no genoma, o material genético de um organismo. Neste módulo vamos estudar alguns aspectos relacionados às mutações. Inicialmente discutiremos o conceito, classificações e a terminologia empregada. Em seguida serão apresentados os principais mecanismos de geração de mutações: espontâneas e induzidas; causas físicas, químicas e biológicas. Também vamos exemplificar de que forma o uso de mutantes é um tema central em estudos de genética, biologia molecular e bioquímica. Finalmente, esperamos transmitir a importância das mutações como fonte de variabilidade e matéria-prima para a evolução.

Todo ser vivo possui um genoma característico, formado por genes estruturais e seqüências não transcritas, que deve ser preservado e transmitido para as gerações futuras. Falhas ocorridas durante a replicação do material genético ou o surgimento de lesões, espontâneas ou induzidas, podem resultar em mutações e estas, por sua vez, podem causar uma série de conseqüências danosas às células e aos organismos. Entre os efeitos prejudiciais para o homem, associados às mutações estão: mal-formações congênitas; anomalias e distúrbios metabólicos de origem genética, como o câncer; resistência a medicamentos em bactérias, vírus e parasitas; pragas capazes de resistir à ação de inseticidas.

Por outro lado, as mutações representam a principal fonte de diversidade genética que, em conjunto com a seleção natural, permite que os organismos se adaptem às contínuas mudanças no ambiente, sendo portanto um elemento benéfico e fundamental para o qualquer espécie viva na natureza.

Pergunta 1: Por que a maioria das mutações traz efeitos prejudiciais ao organismo?

A geração e o estudo de mutantes em laboratório representam ferramentas fundamentais na área de genética e biologia molecular. A comparação de organismos mutantes e selvagens permite desvendar vias metabólicas e funções de determinados produtos gênicos, por exemplo. Na área de biotecnologia, a manipulação de genomas permite a produção de medicamentos e vacinas.

Pergunta 2: Dê um exemplo de como as mutações auxiliam pesquisadores a esclarecer detalhes sobre a genética ou o metabolismo de um ser vivo. Pergunta 3: Como você diferenciaria um indivíduo dito selvagem de um indivíduo mutante? E um alelo selvagem de um alelo mutante?

Classificações das Mutações

Uma mutação é qualquer alteração no conteúdo informacional de uma célula, isto é, na seqüência de bases do material genético. Mutações podem ter efeitos diversos no organismo em função de sua natureza e do local onde ocorrem. Seu efeito pode ser observável no fenótipo ou não. As alterações fenotípicas causadas pelas mutações podem variar desde a ausência de efeito mensurável até a inviabilidade do indivíduo.

Por conveniência as mutações são classificadas em função de determinados parâmetros. Alguns destes parâmetros envolvem, por exemplo, a conseqüência da mutação para o organismo em questão, o tipo de fenótipo resultante, o tipo de célula afetada.

Pergunta 4: Você seria capaz de explicar os critérios em que se baseiam as seguintes classificações de mutações e o que significam os seguintes termos? mutação (i) somática x germinativa; (i) letal x não letal; (i) dominante x recessiva; (iv) gênica x cromossômica; (v) condicional x não condicional; (vi) adaptativa x não adaptativa. Você pode sugerir algum outro parâmetro para classificar mutações? Pergunta 5: Que conseqüências você espera para uma mutação presente em uma célula somática ou em uma célula germinativa?

Outros parâmetros de classificação de mutações se baseiam na natureza da alteração no genoma em termos da extensão de pares de base envolvidos. Por este critério as mutações podem ser divididas em dois grupos: mutações pontuais e rearranjos. As mutações pontuais envolvem modificações de uma única ou um pequeno número de bases nitrogenadas. Os rearranjos resultam em alteração de um grande número de bases, em alguns casos todo o genoma da célula, como no caso de poliploidias.

No caso de mutações pontuais que incidam em genes estruturais, a troca de um par de bases nitrogenadas irá significar a troca de um códon, o que pode vir a alterar um aminoácido na respectiva proteína. Assim, de acordo com o efeito que a mutação terá na seqüência de aminoácidos da proteína codificada, usa-se a seguinte classificação (Fig. 2): . mutações de sentido trocado – troca de um aminoácido na proteína com comprometimento de sua função na célula,

Figura 1 - Mutações do tipo troca de bases podem ser classificadas como transições e transversões

As mutações pontuais podem envolver a substituição de uma base nitrogenada por outra. Estas substituições podem ser transições (troca de uma pirimidina por outra pirimidina ou uma purina por outra purina) ou transversões (troca de uma pirimidina por uma purina e vice e versa) (Fig. 1).

. mutações sem sentido – troca de um códon que codifica um aminoácido por um códon de parada (UAG, UAA, UGA), . mutações neutras – troca de um aminoácido por outro de propriedades semelhantes sem comprometimento da função da proteína codificada; . mutações silenciosas - troca de bases sem uma correspondente troca de aminoácido.

Pergunta 6: O genoma de qualquer organismo é formado por regiões transcritas e não transcritas. Que efeitos podem ter as mutações que incidam nestes locais? Pergunta 7: Que efeito as mutações de troca de base que incidam sobre regiões não transcritas podem trazer sobre a síntese de proteínas específicas?

As mutações pontuais podem envolver perda ou ganho de um ou poucos pares de base na seqüência do genoma. Quando esse tipo de mutação ocorre em um gene estrutural e gera a inserção ou deleção de pares der bases nitrogenadas em número diferente de três ou múltiplo de três, temos as chamadas mutações de troca de referencial de leitura ou “frameshift”. A mudança no referencial de leitura é gerada a partir do ponto em que ocorreu a mutação, resultando em uma seqüência de aminoácidos diferente da original na proteína correspondente (Fig. 3).

Figura 2 - Mutações pontuais que ocorram em um gene estrutural podem ser classificadas de acordo com o efeito sobre a proteína sintetizada

sem sentidosentido trocado neutra silenciosa

Figura 3 -Efeito de mutação do tipo troca de referencial de leitura na síntese da proteína codificada.

A menos que a mutação ocorra próximo ao final da região codificante do gene, é de se esperar que a proteína resultante perca a sua função, já que sua seqüência será em grande parte alterada. Também pode ocorrer que uma mutação de troca de referencial gere um códon de término prematuro e, portanto, a proteína mutante terá um tamanho bem menor que a original e provavelmente não terá função.

Pergunta 8: O que ocorreria nos casos em que ocorre adição ou deleção de bases em número de três ou múltiplo de três?

Os rearranjos envolvem um grande número de bases e, freqüentemente, vários genes. Os rearranjos mais comuns são as inserções (adição de material genético como transposons e seqüências de inserção), deleções (perda de fragmentos contínuos de DNA), amplificações (duplicações ou multiplicações de genes) e translocações (transposição de um gene ou genes para locais diferentes no genoma). Como os rearranjos afetam muitos genes, podem interferir na expressão de varias proteínas.

Pergunta 10: Em que situação a inversão de um gene estrutural pode levar à interrupção da produção da proteína codificada?

A origem das mutações (mutações espontâneas e induzidas) Mutações espontâneas As mutações podem ser classificadas quanto à origem em: mutações espontâneas e mutações induzidas.

Em uma população de células, mutações aparecem espontaneamente numa taxa que varia de 10-6 a 10-8 por geração, dependendo do organismo e do gene estudado. A taxa de mutação é um parâmetro calculado como o numero de mutações observado a cada nova geração - no caso de organismos unicelulares, a cada duplicação celular.

Por que essas mutações aparecem? Mutações espontâneas surgem a partir de erros no processo de replicação do DNA ou a partir de lesões espontâneas no material genético. Em bactérias, a enzima DNA polimerase I, responsável pela replicação do DNA, incorpora um nucleotídeo errado com uma freqüência de 10-4/ base/ célula/ geração. A fonte desses erros pode ser o fenômeno de tautomerização (modificação na localização de elétrons) de bases nitrogenadas. Formas raras tautoméricas possuem propriedades de pareamento diferentes da base original e resultam em mutações quando incorporadas no DNA ou quando são usadas como molde durante a replicação (Fig. 4).

Pergunta 1: Por que a taxa de mutação (medida pela freqüência de mutações) observada é sempre menor do que a taxa de erros durante o processo de replicação do DNA?

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Figura 4 – Formas tautoméricas das bases nitrogenadas possuem propriedades de pareamento diferenres das originais. (A) formas comuns – ceto e amino - das bases nitrogenadas e seu pareamento. (B, C) Formas raras - enol e imino – das bases nitrogenadas e seu pareamento alterado.

Mutações também podem ser originadas a partir de lesões espontâneas no DNA. Uma lesão é uma alteração na estrutura química do DNA, pode incidir sobre uma base nitrogenada, fosfato ou desoxiribose. Essas lesões podem ser eliminadas por mecanismos de reparo mas, caso persistam até o momento da replicação, podem gerar mutações ou mesmo impedir a replicação, levando à morte da célula.

Os casos mais freqüentes de lesões espontâneas no DNA são a depurinização e a desaminação de bases nitrogenadas.

A DNA polimearse I possui também uma atividade de edição (correção) de erros, retirando da molécula nova de DNA nucleotídeos errados recém incorporados (Fig. 5). Isso faz com que a taxa de erro baixe para 10-7 a 10-6 / base/célula/geração. Erros de replicação ainda podem ser corrigidos a seguir por mecanismos de reparo de bases mal pareadas (“mismatch repair”), o que faz com que a taxa de erro baixe ainda mais para 10-10 a 10-9 /base/célula/ geração.

Figura 5 – A atividade de edição da DNA polimerase permite retirar da nova cadeia de DNA um nucleotídeo incorporado erroneamente.

Um nuclotideo incorreto é incorporado a enzima avança uma posição a presença de um par imperfeito causa a remoção do nucleotídeo errado, a enzima retorna uma posição

As desaminações da citosina e da adenina geram uracil e hipoxantina, respectivamente (Fig. 7). Existem mecanismos de reparo específicos que retiram essas bases lesionadas da molécula de DNA. Porém, caso persistam até o momento da replicação, essas lesões são mutagênicas pois os produtos da desaminacao têm propriedades de pareamento diferentes das bases originais e portanto, ao servir de molde, irão alterar a seqüência de bases no DNA, gerando uma mutação pontual. Assim, nos dois casos ocorrem transições, fixadas após a replicação, caso não sejam reparadas.

Erros espontâneos durante a replicação podem resultar numa freqüência maior de mutações do tipo frameshift (troca de referencial) em regiões de seqüências repetitivas de DNA, em comparacao com outras regiões do genoma. Dizemos que essas regiões de seqüência repetitiva são pontos quentes ou “hot spots” (Fig. 8) para mutações desse tipo. Ocorre que as repetições de seqüência favorecem o ‘escorregamento’ de bases: durante a replicação do DNA, quando as duas fitas se separam, podem voltar a parear deslocadas por algumas poucas bases e esse pareamento incorreto pode ser estabilizado justamente devido à repetição de seqüência (Fig. 9). Este processo pode envolver uma ou mais bases repetidas e resulta em adição ou deleção, de acordo com a fita que sofre o ‘escorregamento’.

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