Fixação Biológica do Nitrogênio

Fixação Biológica do Nitrogênio

(Parte 1 de 5)

1. INTRODUÇÃO4
2. DIAZOTROFOS DE VIDA LIVRE6
3. DIAZOTROFOS ASSOCIATIVOS8
3.1. ENDOFÍTICOS FACULTATIVOS8
3.2. ENDOFÍTICOS OBRIGATÓRIOS9
4. DIAZOTROFOS SIMBIÓTICOS14
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS19

Fixação Biológica de Nitrogênio: Bactérias Fixadoras de Nitrogênio de Importância para a Agricultura Tropical

Victor Augustus Marin1

Vera Lúcia Divan Baldani2

Kátia Regina dos Santos Teixeira2 José Ivo Baldani2

1. INTRODUÇÃO

Com a exceção da água, o nitrogênio é geralmente considerado o nutriente mais limitante para o crescimento de plantas no seu ambiente natural (Franco & Döbereiner, 1994). Além do carbono e hidrogênio, o nitrogênio é o nutriente mais abundante na matéria viva, participando na composição de moléculas de ácidos nucléicos, proteínas e polissacarídeos entre outras. Entretanto, apesar de ser requerido em quantidades significativas pelos seres vivos, na natureza este elemento é encontrado em abundância em uma forma quimicamente muito estável e portanto sua pronta assimilação pela maioria dos seres vivos é limitada, requerendo sua transformação para uma forma combinada que facilite sua assimilação.

O aumento da população neste século foi suportada, primeiro, pelo processo de Haber-Bosch (que combina nitrogênio e hidrogênio, formando amônia ou produzindo outros compostos como uréia), sendo necessário cerca de 1,3 toneladas de combustível fóssil para fixar 1 tonelada de nitrogênio em alta pressão (35 a 100 Mpa) e temperatura (300 a 400oC), com cerca de 77x106 toneladas de nitrogênio aplicados globalmente como fertilizante, o requerimento de combustível fóssil é cerca de 91x109 toneladas por ano, isto corresponde a aproximadamente 1,4% de todo o combustível fóssil consumido; e segundo, pela Revolução Verde, que é o aumento da produção de cereais associada a utilização, em doses elevadas, deste tipo de fertilizante sintético. Além do alto consumo de combustível, existem outros problemas como: a contaminação da água e alimentos por NO3 e NO-2, a toxicidade das plantas pela presença de altos níveis de NO-2 nos solos; alteração no

desenvolvimento das plantas pelo excesso de N e a emissão de CO2 contribuindo para o aquecimento global (Bohlool et al. 1992; Döbereiner, 1992; Biological Nitrogen Fixation, 1997; Sprent & Sprent, 1990).

Portanto, considerando que a atmosfera terrestre é composta de 78% de gás dinitrogênio, a introdução do nitrogênio atmosférico, via fixação biológica de nitrogênio (FBN), no circuito dos ciclos biogeoquímicos do nitrogênio tem, frequentemente efeitos positivos no ambiente e na economia (Stacey et al., 1992). O problema básico para a fixação do nitrogênio é a presença da tripla ligação

NºN, o que torna este gás extremamente estável a temperatura ambiente (Sprent &

Sprent, 1990; Evans & Burris, 1992). Apesar da abundância de N2 na atmosfera terrestre, os organismos que pertencem ao grupo dos eucariotos (plantas e animais) não conseguem utilizar este elemento diretamente. Apenas uma porção dos organismos do grupo dos procariotos consegue converter ou reduzir enzimaticamente o nitrogênio da atmosfera em amônia, a qual pode ser incorporada para o crescimento e manutenção das células. Estes organismos são denominados diazotróficos e o mecanismo responsável pela incorporação de N à biomassa é chamado de fixação biológica de nitrogênio (FBN).

Portanto, a FBN é o processo pelo qual a maior parte do nitrogênio atmosférico foi incorporado à matéria viva, ao longo da evolução do nosso planeta. Ainda hoje, este processo constitui a principal via de incorporação de nitrogênio ao ecossistema, que constantemente é reciclado para a atmosfera principalmente pela ação de organismos decompositores de matéria orgânica do solo. Dessa forma, a ação de microorganismos fixadores de nitrogênio e denitrificadores garante um reservatório inesgotável de nitrogênio na atmosfera. Além de garantir um ecossistema em equilíbrio, a redução na aplicação de doses excessivas de compostos nitrogenados, como por exemplo o nitrato, que contamina as águas e os vegetais consumidos pelo homem, possibilita o desenvolvimento de uma agricultura menos agressiva ao ambiente. A estimativa é de que a contribuição de nitrogênio fixado biologicamente varia de 139 a 170x106 toneladas de nitrogênio por ano, pelo menos o dobro da fixação química (Peoples & Craswell, 1992).

Embora uma série de sistemas de fixação de nitrogênio já tenham sido descritos, a FBN é restrita aos organismos procariotos. Dentre estes organismos que fixam nitrogênio (ou diazotrofos) muitos são heterótrofos, necessitando de um suplemento de carbono reduzido, o que depende indiretamente da energia da luz e em geral requer uma simbiose com um hospedeiro eucarioto; ou são de vida livre, competindo com outros microrganismos pela matéria orgânica disponível no ambiente. Outros são autótrofos, os quais podem reduzir o CO2 em presença da luz. Em geral, já foram descritas espécies representantes de vários grupos de procariotos que fixam nitrogênio, tais como: bactérias fotossintéticas (ex.: Rhodospirillum rubrum), bactérias anaeróbicas (ex.:Clostridium spp.), microaeróbicas (ex.: Azospirillum spp., Herbaspirillum spp., Acetobacter diazotrophicus, Azorhizobium caulinodans, Azoarcus spp., Burkholderia spp., etc), bactérias aeróbicas (ex.: Azotobacter spp. e Derxia spp.) e também alguns representantes das cianobactérias (algas verdes-azuladas) e actinomicetos (Frankia) (Sprent & Sprent, 1990; Biological Nitrogen Fixation, 1997). Histórica e economicamente, vários diazotrofos tem sido amplamente utilizados como organismos modelos para investigações em laboratórios. Clostridium pasteurianum, Azotobacter vinelandii e Azotobacter chroococcum foram muito utilizados para o isolamento e caracterização da enzima nitrogenase. As espécies Klebsiella pneumoniae, A. vinelandii, A. chroococcum e Anabaena até hoje são utilizadas como organismos modelo para os estudos de genética e bioquímica da FBN (Haselkorn et al., 1985; Postgate, 1983).

Segundo Evans & Burris (1992), podemos caracterizar três grupos de bactérias fixadoras de nitrogênio, ou diazotrofos: diazotrofos de vida livre, que fixam o nitrogênio para seu próprio uso; diazotrofos associativos, que contribuem para o crescimento da planta sem a formação de estruturas diferenciadas, não estabelecendo uma simbiose e os diazotrofos simbióticos, que estabelecem uma interação muito estreita entre o macro e microsimbionte, e em alguns casos, são formadas estruturas diferenciadas denominadas nódulos.

2. DIAZOTROFOS DE VIDA LIVRE

Com a exceção das bactérias fotossintéticas e cianobactérias que fixam nitrogênio, a maioria das bactérias diazotróficas de vida livre são heterotróficas requerendo ecossistemas capazes de prover uma fonte de carbono utilizável, necessário para a fixação de nitrogênio.

Os diazotrofos de vida livre foram os primeiros a serem reconhecidos, como é o caso de Beijerinkia fluminensis e Beijerinkia indica, isoladas da rizosfera de plantas de cana-de-açúcar crescidas em solos tropicais, sendo demonstrado o seu potencial na associação com gramíneas (Döbereiner & Ruschel, 1958; Döbereiner, 1959). Estas bactérias colonizam preferencialmente o rizoplano e a rizosfera de plantas de cana-de-açúcar, em que os exudados, principalmente açúcares, estão envolvidos nesta associação, pois as bactérias são encontradas principalmente em áreas onde estes compostos são liberados (Döbereiner & Alvahydo, 1959). Representantes do gênero Beijerinkia são aeróbicos, quimioheterotróficos, podendo crescer em solos ácidos (pH 3,0 e 4,0). A eficiência da FBN neste grupo de diazotrofos é geralmente 10 - 13 mg N/g glicose consumida em um meio livre de nitrogênio contendo 1 ou 2% de carboidrato (Becking, 1991).

Bactérias do gênero Klebsiella e Enterobacter da família Enterobacteriaceae são anaeróbicas facultativas que fixam nitrogênio, porém requerem compostos nitrogenados para crescer sob condições estritamente anaeróbicas. Entretanto, as condições para fixação de N2 em K. pneumoniae, descritas por Mahl et al. (1965), revelaram que quando nitrato está presente no meio de cultivo pode ser utilizado como aceptor final de elétrons da cadeia respiratória permitindo dessa forma a geração de energia suficiente para o processo de FBN.

A família Azotobacteraceae é representada por dois gêneros, Azotobacter e

Azomonas, sendo todos aeróbicos, heterotróficos e fixadores de nitrogênio. Dentre as espécies de Azotobacter conhecidas, as mais comuns são A. chroococcum, A. vinelandii e A. paspali, sendo esta última a mais estudada ecologicamente. Azomonas spp. têm sido encontradas em habitats de água corrente. Existe somente um relato na literatura sobre a ocorrência de uma espécie desse gênero em solo, a A. macrocytogenes, diferindo das outras espécies por utilizar como fonte de carbono manitol e maltose e por não utilizar malonato (Döbereiner et al, 1995; Becking, 1991b).

Segundo Baldani et al. (1997) a atual função das bactérias de vida livre na associação com as gramíneas é uma questão que ainda requer esclarecimento. Entretanto, somente em um caso, há uma forte evidência de que um diazotrofo de vida livre, Azotobacter paspali, contribua para a acumulação de nitrogênio na planta. Os resultados de Boddey et al. (1983) revelaram, através da técnica de diluição isotópica de 15N, que em Paspalum notatum cv. Batatais cerca de 20 kg de N acumulado.ha-1.Ano-1 foi derivado da FBN, devido a associação muito específica desta gramínea com o diazotrofo rizosférico A. paspali (Döbereiner, 1966).

3. DIAZOTROFOS ASSOCIATIVOS

Dentro deste grupo podemos dividir os diazotrofos em dois grupos de acordo com a proposição de Baldani et al. (1997a): endofíticos facultativos (podem colonizar tanto a rizosfera como o interior das raízes) e os endofíticos obrigatórios (colonizam o interior das raízes).

3.1. Endofíticos Facultativos

Somente após a redescoberta do gênero Azospirillum (grupo predominante nos endófitos facultativos) por Döbereiner & Day (1975), os cientistas no mundo todo mostraram interesse na associação dos diazotrofos com as gramíneas (Döbereiner & Baldani, 1982). O isolamento das espécies de Azospirillum como fixadores de nitrogênio se deveu a introdução de meios semi-sólidos sem N. O desenvolvimento do meio semi-sólido foi um fato muito importante para o isolamento de diazotrofos com caracter microaerofílico. No caso de Azospirillum e outros diazotrofos, o crescimento dependente de fixação de N2 ocorre em regiões do meio de cultura onde a taxa de difusão de O2 está em equilíbrio com a taxa de respiração das bactérias e, posteriormente, a película formada vai se deslocando até a superfície do gradiente de oxigênio, graças ao fenômeno de aerotaxia (Döbereiner et al., 1995). Os microrganismos desse gênero colonizam tanto o interior quanto a superfície das raízes de várias gramíneas forrageiras e cereais, sendo então chamado de diazotrofo endofítico facultativo (Döbereiner & Baldani, 1982).

A distribuição ecológica de Azospirillum spp. é extremamente ampla podendo ser considerada uma bactéria universal encontrada colonizando plantas crescidas em diferentes habitats (Döbereiner et al., 1976; Döbereiner & Pedrosa, 1987). Estirpes tem sido encontradas em associação com plantas monocotiledôneas, incluindo milho, arroz, cana-de-açúcar, sorgo, gramíneas forrageiras como Digitaria e “Kallar grass” (Döbereiner et al., 1976; Haahtela et al., 1981; Reinhold et al., 1986; Rennie, 1980; Wong & Stemberg, 1979) e com as dicotiledôneas (Rao &

Vankateswartu, 1982). O gênero foi definido por Tarrand et al. em 1978 e hoje compreende seis espécies, caracterizadas com base fenotípica, análise do DNA:DNA e sequência da 16S rRNA: A. brasilense e A. lipoferum (Tarrand et al., 1978), A. amazonense (Magalhães et al., 1983), A. halopraeferens (Reinhold et al, 1987), A. irakense (Khammas et al., 1989) e A. largomobile (Dekhil et al., 1997).

Tanto A. lipoferum como A. brasilense utilizam malato como fonte de carbono, mas somente o primeiro consegue utilizar glicose (Baldani et al., 1997a). As duas espécies também tem a habilidade para produzir fitohormônios como IAA. Os genes para a biossíntese desse fitohormônio foram encontrados também em A. amazonense, mas não em A. irakense (Vandebroek & Vanderleyden, 1995). A habilidade para utilizar sacarose é a principal característica de A. amazonense e A. irakense, embora somente a primeira espécie seja hábil para crescer em vários pHs, sendo que para as demais espécies é requerido um pH perto do neutro. O ótimo crescimento com relação a temperatura, está entre 32 e 37ºC, sendo que A. halopraeferens tem um crescimento ótimo a 41ºC e possui tolerância à condições salinas. Complementando, A. irakense hidrolisa pectina e também tolera altas concentrações de sais (Baldani et al., 1997a; Döbereiner et al, 1995). Várias estirpes de Azospirillum reduzem nitrato a nitrito, o qual é acumulado no meio semi-sólido ou sob condições anaeróbicas, e nitrito a óxido nitroso e dinitrogênio (Döbereiner, 1991).

Segundo Baldani et al. (1997a), embora várias características ecológicas e fisiológicas estejam sendo desvendadas, ainda falta conhecimento sobre o mecanismo envolvido na interação bactéria-planta e como ele contribui para o nitrogênio acumulado nas plantas. Apesar das diferentes formas de interação, estes diazotrofos, quando estão em associação com gramíneas, garantem aumentos de 5 a 30% na produção (Baldani et al., 1983; Okon & Labandera-Gonzalez, 1994).

3.2. Endofíticos obrigatórios

Entre os diazotrofos endofíticos obrigatórios estão: Acetobacter diazotrophicus (Cavalcante & Döbereiner, 1988), Azoarcus spp. (Reinhold-Hurek et al., 1993), Herbaspirillum seropedicae (Baldani et al., 1986), Herbaspirillum rubrisubalbicans (Baldani, 1996; Gillis et al., 1991; Baldani et al., 1996) e Burkholderia spp. (Yabuuchi et al., 1992; Baldani et al., 1997b). Essa característica, descoberta recentemente, parece ser a chave para explicar a contribuição de fixação de N2 muito mais eficiente das associações endofíticas, especialmente nos trópicos, do que das associações rizosféricas (Döbereiner, 1995; Döbereiner et al., 1995). Além destas, outros diazotrofos de caráter anaeróbio são capazes de colonizar a endorizosfera e vasos do xilema, como Alcaligenes faecalis em arroz (You & Zhou, 1989) e Pantoea agglomerans em aveia (Ruppel et al., 1992), além de Bacillus spp., K. pneumoniae, Erwinia sp., Enterobacter sp. e vários outros diazotrofos (Di Fiore & Del Gallo, 1995: McInroy & Kloepper, 1995; Palus et al., 1996; Stoltzfus et al., 1997). Mas de acordo com Döbereiner e Pedrosa (1987), os diazotrofos anaeróbios apresentam baixa capacidade de conversão da energia a partir de fontes de carbono. Assim, os benefícios dessa associação parecem ser limitados pela disponibilidade de substratos orgânicos.

A. diazotrophicus é uma bactéria microaeróbia, que tem a capacidade de crescer em baixo pH (5,0 ou menos), produzir ácido acético a partir de etanol, tolerar altas concentrações de sacarose (10%) e inibir parcialmente a fixação de NH4, especialmente em altas concentrações de sacarose (Gillis et al., 1989; Teixeira et al., 1997; Boddey et al., 1991; Stephan et al., 1991). É encontrada principalmente associada com plantas contendo alta concentração de açúcar, como cana-deaçúcar, batata-doce e capim cameroon (Pennisetum purpureum), todas propagadas vegetativamente (Baldani et al., 1997). Esta bactéria ocorre em números elevados no interior do colmo da cana-de-açúcar e possibilita a fixação de nitrogênio, mesmo na presença de nitrato absorvido do solo, já que não possui a redutase do nitrato. Além da cana, também foi verificada a presença de A. diazotrophicus em tecidos cafeeiros (Jiménez-Salgado et al., 1998). A ocorrência restrita deste diazotrófico foi confirmada pela sua completa ausência no solo e em tecidos de plantas daninhas crescidas entre e dentro das fileiras de experimentos de campo com cana-de-açúcar (Döbereiner et al., 1988). Estes resultados foram também confirmados usando primers espécie-específico desenhados para discriminar A. diazotrophicus de outras espécies de Acetobacter e outros diazotrofos (Reis et al., 1995). Outra característica única desta bactéria é a habilidade para excretar parte do nitrogênio fixado para o meio de cultura como sugerido por Cojho et al. (1993). Estes autores utilizaram levedura durante o co-cultivo com A. diazotrophicus, como modelo de interação diazotrofo-planta, observando acúmulo de 30 a 40% desse nitrogênio no início do crescimento, liberando depois quase metade dele para a levedura. Mais recentemente, resultados de Cruz et al. (1995) sugerem que a amônia é o produto excretado por A. diazotrophicus sob condições de fixação de nitrogênio.

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