Biologia Molecular

Biologia Molecular

(Parte 1 de 10)

UMIVERDIDADE DE SAO PAULO

FACULDADE DE CIENCIAS FARMACEUTICAS

DEPARTAMENTO DE ANALISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS

LABORATORIO DE BIOLOGAI MOLECULAR ALPLICADA AO DIAGNÓSTICO

Apostila de noções de Biologia molecular

Prof. Dr. Mario H. Hirata

Profa. Dra Rosário D. C., Hirata

1999

ÍNDICE

Tópico Página

Aula número 1:

  • Introdução 2

Estrutura do DNA e RNA 2

Replicação, transcrição e tradução 4

Organização do genoma de eucariotos, procariotos e viral 7

Enzimas de restrição e suas aplicações 10

Aula número 2:

  • Extração do DNA genômico 13

Aula número 3:

  • Princípios de eletroforese 19

Fatores que influenciam na eletroforese 20

Tipos de suporte 22

Tipos de eletroforese 22

Aplicações da eletroforese nas técnicas moleculares 23

Aula número 4:

  • Reação de polimerização em cadeia (PCR) 28

Princípios da reação de PCR 28

Protocolo geral para PCR 31

Fatores que influenciam na PCR 31

Escolha de iniciadores para PCR 35

Aula número 5:

  • PCR no Diagnóstico das Doenças genéticas 39

Polimorfismo e mutações 39

Diagnóstico de alguns polimorfismos por PCR 41

Polimorfismo de apolipoproteína 42

Polimorfismo de receptores da LDL 44

Aula número 6:

  • PCR no diagnóstico de Doenças infecto-contagiosas 46

Meningites bacterianas 47

Tuberculose 50

Infecção pelo virus da Hepatite C 59

Infecção pelo virus HIV 64

Aula número 7:

  • PCR e RFLP na identificação de indivíduos 68

Aplicação da PCR em Laboratório Clínico e Medicina Forense

  • Aula número 1

Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata

Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata

  • Introdução

Os avanços nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido significantemente para o entendimento da etiologia das doenças humanas. As técnicas de recombinação dos ácidos nucleicos têm permitido aos pesquisadores identificar os vários genes responsáveis por doenças hereditárias, avaliar os mecanismos de infecção dos microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciação e proliferação celular (principalmente nos processos neoplásicos), entre outros. A biologia molecular vem também apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no diagnóstico laboratorial. Por outro lado, as diferenças nas sequências do DNA, observadas entre as espécies ou entre os indivíduos, são extremamente úteis para as análises forenses, os testes de paternidade, a identificação de antígenos de histo-compatibilidade, a identificação de allelos mutantes, a identificação de gêneros e espécies de bactérias, fungos, leveduras, vírus e outros.

Nesta apostila serão abordados os princípios básicos de biologia molecular, bem como serão descritas as aplicações da técnica de PCR no diagnóstico clínico e nos testes de identificação.

  • Estrutura dos ácidos nucleicos (DNA e RNA)

As informações genéticas são armazenadas nos ácidos nucleicos. Há dois tipos de ácidos nucleicos: ácido desoxiribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). O DNA é encontrado principalmente nos cromossomos no núcleo das células, enquanto RNA está presente no citoplasma, havendo muito pouco nos cromossomos.

Os ácidos nucleicos consistem de cadeias de nucleotídeos. Cada nucleotídeo é constituido por uma base nitrogenada, uma molécula de açúcar e um grupamento de fosfato (PO4=). Há dois tipos de açúcar nos ácidos nucleicos: 2-deoxiribose noDNAe ribose no RNA (Figura 1A). As bases nitrogenadas são as pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U) e as purinas: adenina (A) e guanina (G). O DNA contém A, C, G e T, enquanto que o RNA contém U em vez de T. Em ambos DNA e RNA, os nucleotídeos estão ligados formando uma longa cadeia cadeia polinucleotídica. Essa cadeia é formada por ligações entre o grupo fosfato do carbono 5 de um nucleotídeo e o carbono 3 do açúcar do nucleotídeo adjacente (Figura 1B).

Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotídica simples, enquanto que o DNA é composto de duas cadeias polinucleotídicas pareadas, dispostas em direção contraria, sendo denominadas antiparalelas (Figura 1B). As ligações covalentes do esqueleto de açúcar-fosfato localizam-se na parte externa da estrutura e as bases nitrogenadas estão projetadas para a parte interna. O arranjo das bases na molécula de DNA segue uma sequência em que cada base de uma cadeia é pareada com outra base na segunda cadeia, de modo que guanina em uma cadeia é pareada com a citosina na outra cadeia e a adenina sempre pareia com a timina (Figura 1C). Dessa forma o DNA apresenta a estrutura tridimensional de dupla hélice, onde o ângulo e a distância entre um nucleotídeo e outro é sempre constante.

(A)

(B)

2-deoxiribose

ribose

(C)

5’ fosfato 3’ hidroxila

3’ hidroxila 5’ fosfato

Figura 1. Características estruturais das moléculas dos ácidos nucleicos. (A) Molécula do açúcar. (B) Representação diagramática do arranjo antiparalelo das duas cadeias polinucleotídicas do DNA. P representa o grupo fosfato. (C) Pareamento da bases na molécula de DNA mostrando as pontes de hidrogênio.

E. CHARGAFF, em 1951, verificou que na molécula de DNA a relação entre as purinas e pirimidinas era constante na maioria das espécies animais, ou seja, a quantidade da purina, adenina, é igual a da pirimidina, timidina; da mesma forma, a quantidade da purina guanina é igual à da pirimidina citosina. Essa característica importante é definida pela propriedade fisico-química das moléculas com formas semelhantes se atrairem mutuamente com significante afinidade (força de atração de Van Der Waals), somada à força de atração entre os átomos de cargas opostas (ligações iônicas ou pontes de hidrogênio). Essas propriedades são bastante específicas e no caso do DNA elas operam de forma conjunta e simultânea com significante energia de interação, como se fosse um molde perfeito. Em resumo, pode-se dizer que a lei de CHARGAFF se baseia na especificidade da interação das bases puricas e pirimidicas, onde a citosina pareia apenas com a guanina e a adenina pareia apenas com a timidina ou uracila. É importante salientar que a ligação entre a A e T ou U ocorre por interação de 2 pontes de hidrogênio, enquanto que entre a C e a G a ligação se dá por 3 pontes de hidrogênio (ligação mais forte). Devido a essa especificidade do pareamento entre as bases; a sequência de uma das cadeias polinucleotídicas do DNA é complementar a outra (cadeia complementar).

A estrutura secundária de dupla hélice (duplex) do DNA, descrita por Watson & Crick em 1953, está disposta linearmente. Entretanto, pode ser também circular como nas bactérias, plasmídeos e certos vírus, e pode ser também de fita simples como em alguns tipos de fagos. Entretanto, a disposição da molécula de DNA nos organismos superiores é de particular importância, onde a informação genética está amplamente concentrada nos cromossomas dentro do núcleo. O comprimento total dos 46 cromossomas humanos tem menos que 0,5 mm, entretanto se extendido pode atingir muitos metros. Isto se deve a que o DNA é compactado na forma super-enrolada em vários níveis: primário, duplex; secundário, ao redor das proteinas ligadas ao DNA (histonas) formando os nucleossomos; terciário, enrolado com os nucleossomas formando um cilindro ou estrutura solenoide; e finalmente quaternária, formando voltas ou “loops”. Esta disposição super-enrolada é a forma natural do DNA.

Propriedades dos ácidos nucleicos

Os ácidos nucleicos podem ser dissociados e associados por processos físicos e químicos. Em condições fisiológicas, a estrutura de dupla hélice do DNA é bastante estável. No entanto, se essa estrutura for submetida a alta temperatura (90C a 100C) ou a pH extremos (menor que 3,0 ou maior que 10,0), ela se separa em duas fitas simples, sofrendo o processo de dissociação, desnaturação ou “melting”. Da mesma forma, ao submeter-se essas fitas simples a condições de associação (temperatura  a 65C, ou pH próximo de 7,0) por algumas horas, elas podem se reconstituir formando a dupla fita novamente, obedecendo a lei da complementariedade; ou seja a dupla fita somente se reassocia se as bases forem exatamente complementares. Esse fenômeno de associação é também denominado de renaturação, hibridização ou “annealing”. Esses processos de desnaturação e renaturação são essenciais para manipulação dos ácidos nucleicos in vitro, principalmente do DNA, contribuindo enormemente para o isolamento, comparação e identificação desses compostos. Outra propriedade física muito importante dos ácidos nucleicos é a sua capacidade de absorver energia na região do ultravioleta, apresentando o pico de absorbância máxima em 260 nm. Esta propriedade é útil tanto para a quantificação quanto para avaliar a pureza dessas substâncias.

  • Replicação, transcrição e tradução

Replicação

Toda vez que uma célula se divide, todo o seu conteúdo de DNA é duplicado na íntegra, transmitindo em absoluto as informações genéticas contidas na célula precursora, esse processo denomina-se replicação. A replicação ocorrre de forma semi-conservativa, com as duas cadeias precursoras (DNA de dupla fita, dsDNA) servindo de molde para a síntese da nova cadeia (Figura 2). Dessa forma, para a replicação ocorrer é necessário que dupla fita precursora se abra formando 2 cadeias independentes (fita simples, ssDNA). Esse é um processo energeticamente desfavorável e ocorre com a ação conjunta de uma proteina DNA-específica e várias enzimas; sendo as fitas simples precursoras replicadas, então, de forma independente e separada. A replicação pode ter início em vários sítios, mas cada origem de replicação é utilizada uma vez, durante um simples ciclo celular. A fita filha é sintetizada pela ação catalizadora da DNA polimerase III, enzima que utiliza como molde a cadeia precursora e incorpora os nucleotídeos de forma sequencial na nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases. Como essa polimerase sintetiza DNA na direção de 5' para 3', a síntese de uma das cadeias complementares é realizada de forma contínua enquanto que a outra é sintetizada discontinuamente. Os fragmentos da cadeia discontínua são ligados pela enzima DNA ligase. Muitas outras proteínas estão envolvidas na estabilização e manutenção da integridade das cadeias simples que são precursoras para a síntese da dupla fita, assim como no reconhecimento dos sítios de iniciação. As DNA polimerases possuem também, além da função de sintetizar polinucleotídeos, atividade exonucleásica ou "a correção de leitura" na qual os nucleotídeos incorretamente incorporados são removidos. Essa propriedade é fundamental para a manutenção a integridade da sequência original.

Figura 2. Representação da molécula de DNA durante a replicação: as duas cadeias precursoras são separadas e as cadeias complementares que são sintetizadas.

Transcrição

A síntese protéica não é resultante da leitura direta da sequência nucleotídica do DNA. Sabemos que o DNA está localizado no cromossoma do núcleo da célula e a síntese protéica ocorre quase que na sua totalidade nos ribossomas, localizados no citoplasma. As informações genéticas contidas na sequência nucleotídica do DNA têm que ser transferidas para uma molécula intermediária que pode mover-se para o citoplasma, o RNA mensageiro (mRNA), e que ordena, então, a síntese da proteina. O processo de síntese de mRNA é conhecido por transcrição e o tamanho da molécula de mRNA é definido pela sequência de aminoácidos que o ácido nucleico codifica.

Apenas uma das fitas do DNA é transcrita dando origem a uma única sequência de mRNA para cada gene. A indicação de qual fita do DNA deve ser transcrita é orientada por uma sequência específica denominada promotor, localizada antes (“upstream”) da sequência a ser transcrita,que é reconhecida pela RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA). Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosídeo à extremidade 3’ da cadeia de RNA em crescimento, a polimerização ocorre na direção 5’ - 3’. Isto significa que cada molécula de mRNA será identica à sequência nucleotídica da fita de DNA que não é transcrita. O mRNA transcrito é transportado para os ribossomos (RNA ribossômico, rRNA) no citoplasma, onde ocorre a síntese protéica.

O material genético de certos virus (retrovirus) é o RNA e a informação genética segue, portanto, a direção reversa (de RNA para DNA). Este processo é conhecido por transcrição reversa, na qual a sintese de DNA é dirigida pelo RNA e a enzima responsável é denominada transcriptase reversa. Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos retrovírus.

Tradução

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