Apostila aulas praticas bioquimica

Apostila aulas praticas bioquimica

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

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PRÁTICA No 1 - FUNDAMENTOS DE FOTOMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO

1. Princípios gerais

O termo espectro foi utilizado inicialmente por

Newton, quando este descobriu que a luz branca, ao atravessar um prisma, é dividida em várias cores. Atualmente, sabe-se que o espectro visível é apenas uma pequena parte do espectro eletromagnético. A luz é, portanto, definida como uma forma de energia eletromagnética, formada por ondas que apresentam comprimentos diferentes. O comprimento de onda (λλλλ) é medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10-9 m. A tabela abaixo mostra as regiões do espectro em relação ao comprimento de onda:

REGIÃO: (λλλλ) EM nm: Raios X 0,1-100

Ultravioleta 100-400 Visível 400-800 Infravermelho 800-5000 Microonda 5000-30000

A cor dos objetos é devida a duas causas: reflexão e absorção. Assim, um papel transparente, vermelho, recebe todos os λλλλ da luz branca, mas reflete e transmite somente o vermelho, sendo o restante absorvido. Quando um objeto é da cor branca, todos os λλλλ são refletidos, se é negro, é porque, praticamente, todos os λλλλ são absorvidos. No entanto, existe uma cor

(ou λλλλ) que é mais absorvida, a qual corresponde à chamada cor complementar. Se uma solução absorve na faixa de 435-480 nm, que corresponde à radiação azul, a sua cor (cor complementar) será o amarelo; a sensação visual do amarelo será dada pelo conjunto de todos os outros componentes da luz branca, que não foram absorvidos. A tabela abaixo mostra as cores de cada intervalo de radiação da faixa do visível e as suas respectivas cores complementares:

A capacidade que as diversas substâncias químicas têm de absorverem luz em determinados comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinação quantitativa e qualitativa, uma vez que o espectro de absorção é característico para uma determinada substância e a quantidade de absorção (intensidade) é dependente da concentração do composto.

A intensidade da radiação transmitida por uma solução pode ser determinada em aparelho (fotômetro), que deverá ser constituído de: uma fonte luminosa, um seletor de λλλλ (filtro ou prisma), um compartimento para a amostra, uma célula fotoelétrica (ou fototubo) e um sistema para amplificação e medida do sinal (corrente elétrica) proveniente da célula fotoelétrica (medidor de potencial elétrico = potenciômetro). Pode-se selecionar o comprimento de onda que incidirá sobre a solução usando-se um monocromador (prisma ou retículo de difração) ou um filtro óptico (vidro colorido ou quartzo, que transmite uma determinada faixa de λλλλ na região do ultravioleta, UV). Se o aparelho dispõe de filtro óptico, é denominado fotômetro ou fotocolorímetro e se dispõe de prisma ou retículo é denominado de espectrofotômetro. Este último é muito útil, pois pode selecionar faixas de comprimentos de onda

(nm) COR ABSORVIDA COR COMPLEMENTAR

380-435 violeta Verde-amarelada

435-480 azul amarela 480-490 azul esverdeada alaranjada 490-500 verde azulada vermelha 500-560 verde púrpura 560-580 Verde- amarelada violeta 580-595 amarelada azul 595-650 alaranjada Azul-esverdeada 650-780 vermelha verde-azulada extremamente estreitas, nas regiões do UV, visível e infravermelho (IV).

A fotometria de absorção, portanto, presta-se tanto para a medida da concentração de compostos naturalmente corados, como daqueles incolores, mas passíveis de adquirirem cor mediante o emprego de certos reativos, bem como de compostos incolores que absorvem UV ou IV. Esta metodologia, por conseguinte, tem largo emprego na química analítica quantitativa. Alguns poucos exemplos: na determinação de atividade enzimática ou nas dosagens de compostos orgânicos em fluidos biológicos, como glicose, uréia, proteínas, etc., em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de uma reação química, ou um produto incolor que absorva na região do UV ou do IV. Ensaios imunológicos quantitativos (como o ELISA: Enzyme-Linke ImmunoadSorbent Assay) também usam a fotometria.

1.1. Leis da fotometria

O princípio básico da fotometria é baseado no fato de que: partículas dispersas ou dissolvidas em uma solução interferem seletivamente com um raio de luz que passa através desta solução. Esta interferência depende dos seguintes fatores: a) cor do composto ou do tipo de ligação química presente; b) tamanho da partícula; c) transparência da solução; d) combinação dos fatores acima.

Deste modo, as partículas podem absorver e transmitir parte do espectro, dependendo da sua concentração, da sua natureza química e/ou da sua cor.

Se pudermos medir o total de luz que incide (Io ) sobre a solução de uma determinada substância e o total da luz transmitida (It), podemos avaliar o quanto a substância absorveu (absorvância: A) O esquema abaixo mostra como funciona um fotômetro ou um espectrofotômetro:

A seguinte formulação pode ser feita:

Transmissão = It / Io (luz transmitida / luz incidente). Observe que o termo transmissão tem aplicação limitada, uma vez que, a It é I0 menos a luz que é absorvida não só pela substância que se deseja medir, mas também pelo solvente, pelo material da cubeta e por outras substâncias aí existentes. Assim, It é a luz transmitida após as absorções pela substância de interesse mais os interferentes. Para corrigir tal efeito, admite-se It =1 (100% de Transmitância) a luz transmitida após I0 atravessar a cubeta contendo uma solução denominada branco. Este branco contém todos

há luz transmitida a ser medida

os componentes do meio, exceto a substância a ser medida. No escuro, bloqueada a passagem de luz para o fototubo (fotocélula), a Transmitância = 0, ou seja, não

Na prática, a transmitância (T), que é medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco na passagem da luz), é pouco utilizada, pois é substituída pelo valor de densidade óptica (D.O.) ou absorvância (A), termo mais aceito atualmente, que corresponde ao logaritmo do inverso da transmitância:

A = log 1/T A absorvância é, desta forma, medida em uma escala de 0 (log 1/1) a infinito (log 1/0). A relação da A com a concentração da substância pode ser compreendida pelas Leis de Lambert-Beer: a absorvância de uma solução é proporcional à concentração da substância na solução e à distância percorrida pelo feixe luminoso que atravessa a solução

(caminho óptico): A = εεεε. l.c, onde: εεεε = coeficiente extinção molar, que é constante para cada substância, e definido como a absovância (A) de uma solução l molar da substância em um determinado comprimento de onda (λλλλ), numa cubeta de caminho óptico l = l cm (largura da cubeta) e c = à concentração da solução.

Observe, portanto, que a absorvância é uma função linear da concentração. Assim, para uma mesma substância, considerando-se o caminho óptico constante, a A é diretamente proporcional à concentração desta substância. No entanto, as Leis de Lambert–Beer nem sem pre são obedecidas. Algumas desobediências são conhecidas e atribuídas a fatores como: mudança na natureza do soluto, valores muitos altos ou muitos baixos das concentrações das soluções, etc. Também as presenças de ácidos, bases e sais na solução podem contribuir para essas desobediências, por estarem mais completamente dissociados, à medida que aumenta a diluição, visto que absorção da luz pelos íons é diferente daquela apresentada pelas moléculas não ionizadas. Para se evitar discrepâncias das Leis de Lambert-Beer, devese trabalhar com soluções mais diluídas e construir, previamente, uma curva padrão, em que são usadas concentrações conhecidas (e crescentes) da substância em análise, e verificar as absorvâncias no comprimento de onda indicado e na cubeta de caminho óptico adequado. Desta forma, teremos os limites de concentração nos quais a solução obedece às Leis de Lambert-Beer, ou seja, onde há linearidade. Com o emprego da curva padrão, podemos, também, determinar a concentração de uma solução problema. O comprimento de onda (λλλλ) usado para a obtenção da curva padrão é obtido pela preparação do espectro de absorção da substância em estudo e é, normalmente, o λλλλ onde a absorvância para a substância apresenta o valor máximo.

2. Objetivos

• Determinar o espectro de absorção de uma solução de permanganato de potássio;

• Caracterizar o comprimento de onda (λλλλ) onde ocorre absorção máxima;

• Construir uma curva padrão do permanganato de potássio.

3. Reagentes • Solução de KMnO4 3 mg /100 mL.

4. Procedimentos 4.1. Procedimentos gerais de ajuste do fotômetro

• Ligar o aparelho;

• Selecionar o comprimento de onda adequado.

• Ajustar o zero de transmitância;

• Introduzir a cubeta com o branco (água destilada) e ajustar a 100% de transmitância, no botão correspondente;

• Repetir os ajustes acima.

• Obtenção do espectro de absorção:

• Ajustar o comprimento de onda inicialmente em 450 nm;

• Ajustar o 100% de transmitância com o branco. Isto coincide com o 0 de absovância;

• Colocar a cubeta com a solução de permanganato de potássio à concentração de 3 mg/100 mL;

• Ler a absorvância e registrá-la;

• Ajustar o λλλλ a 490 nm, repetir o ajuste do branco, recolocar a solução de permanganato e ler, novamente, a absorvância correspondente a este λλλλ;

• Repetir estas operações para os seguintes valores de λλλλ: 530, 570 e 610;

• Fazer o gráfico do espectro de absorção do permanganato em papel milimetrado, relacionando absorvância (ordenada) contra λλλλ (abcissa); • Determinar o λλλλ de absorção máxima.

450

λλλλ A 490

530
570
610

4 Dados:

1) Espectrofotômetro: TURNER, modelo 330. 2) Solução: KMnO4 ( 3 mg/ 100 mL ). 3) λλλλ - Comprimento de onda. 4) A - Absorvância.

4.2. Curva padrão - Obtenção

• Preparar soluções de permanganato de potássio nas concentrações citadas na tabela abaixo:

Concentração de KMnO4

(mg/100mL) Absorvância

3,0
2,0
1,50
1,0
0,75
0,50

• Ler as absorvâncias das diferentes soluções de permanganato (λλλλ : 530 nm) e registrá-las;

• Construir, em papel milimetrado, a curva padrão (absorvâncias na ordenada e concentrações na abcissa), considerando os pontos zero de absorção e de concentração.

5. Questões para discussão 5.1- Você dispõe dos filtros azul, verde, vermelho e amarelo de um fotômetro. Qual deles você usará, para que uma solução de cor vermelha tenha uma absorção (contra o branco) o mais próximo de zero possível? 5.2- Avalie, nas condições experimentais acima, se o permanganato de potássio segue, estritamente, as Leis de Lambert-Beer, admitindo que nada interferiu em seu procedimento. 5.3- Explique por que não se deve usar cubetas de vidro para leituras na região do ultravioleta..

Amostra...................... ...0,180
P-10 mg/100mL............. 0,150
P-20 mg/100mL..............0,298
P-30 mg/100mL..............0,400.

6. Questões complementares 6.1 – Você pesou l, 2 e 3 mg de permanganato de potássio e dissolveu cada uma quantidade em 50 mL. As absovâncias destas soluções, em 530nm, foram, respectivamente, 0,2, 0,4 e 0,6. A abosvância de uma solução desconhecida do sal foi 0,3. Calcule a sua concentração, em mg/100mL. 6.2 – Para a dosagem da glicose do sangue de um paciente, a amostra foi diluída em 10 vezes (no processo de desproteinização). 1mL do desproteinizado e 2mL de cada um dos padrões de glicose (P) de 10, 20 e 30mg/100mL foram processados para a dosagem da glicose, sendo o volume final, em todos os tubos, ajustados para 5mL. Após as leituras espectrofotométricas em comprimento de onda adequado, as absorvâncias obtidas foram: Qual a concentração da glicose no sangue do paciente?

6.3 - O coeficiente de extinção molar (εεεε) de uma substância de peso molecular 200 é 14,5. Uma solução desta substância apresentou , numa cubeta de caminho óptico de 2 cm, a absorvância de 0,800. Qual a concentração (em mg/L) da substância nesta solução?

PRÁTICA No 2 - ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO DAS PROTEÍNAS

1. Introdução

As proteínas, excluindo a água, são os compostos químicos mais abundantes nos organismos, com extrema versatilidade de conformações e funções. O estudo de aspectos importantes da bioquímica nos leva, invariavelmente, ao estudo de proteínas. Portanto, torna-se importante a existência de métodos adequados de purificação e quantificação destes compostos. A purificação e caracterização de uma proteína baseiam-se em suas características físico-químicas. Por serem formadas por aminoácidos e considerando-se que os aminoácidos aromáticos absorvem luz na região ultravioleta, as proteínas, em geral, podem ser detectadas através da absorção de luz a 280 nm. No entanto, a detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações específicas com determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação. Dentre os métodos utilizados, situa-se o método do biureto, que é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo do biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos). O nome do método provém do fato de que a uréia aquecida a 180oC dará reação positiva com desprendimento de amônia:

NH3

NH2

NH2 NH2

N H 0C

URÉIA

Quando a substância contém duas ou mais ligações peptídicas, produz uma cor azul-violeta com o reativo de biureto. Esta cor desenvolvida é devida a um complexo entre o íon cúprico e duas cadeias peptídicas adjacentes:

0C

Cu+2

Dependendo dos aminoácidos que fazem parte das proteínas (estrutura primária), podem-se ter diferenças fisico-químicas individuais entre proteínas numa mistura, as quais podem ser utilizadas para a separação e purificação destes compostos. Por exemplo, métodos cromatográficos podem ser baseados em diferenças no peso molecular e/ou carga elétrica.

As proteínas são macromoléculas coloidais, possuem uma camada de solvatação ou hidratação. Ao seu redor interagem moléculas de água, que permitem a sua solubilidade. Diversas substâncias, entre elas os sais inorgânicos ((NH4)2SO4, Na2SO4 e outros) podem alterar a camada de solvatação de proteínas, aumentando

(“salting-in”) ou diminuindo (“salting-out) a solubilidade.

As proteínas possuem estruturas espaciais bem definidas que, segundo o nível de complexidade, podem ser caracterizadas como estruturas secundária, terciária e quaternária. A função biológica está associada à estrutura espacial, que, por sua vez, depende da estrutura primária (a simples disposição dos aminoácidos na cadeia polipeptídica). Certos agentes podem alterar a conformação espacial original das proteínas, sem que ocorra alteração da estrutura primária, modificando, desta forma, algumas de suas propriedades biológicas. Este efeito, chamado de desnaturação, pode ser produzido pelo aumento da temperatura do meio, alteração do pH ou pela adição de solventes orgânicos. A alteração da estrutura primária das proteínas (quebra das ligações peptídicas) ocorre por tratamento à quente (100oC) em presença de ácido ou base forte ou através de adição de enzimas proteolíticas. Determinados agentes podem ser usados na precipitação de proteínas, o que é útil na desproteinização de materiais biológicos, como o sangue: ânions de ácidos complexos (tricloroacético, tânico, fosfotúngstico) formam sais insolúveis onde a proteína funciona como cátion; metais pesados (cobre, zinco, prata, mercúrio) em meio alcalino formam precipitados onde a proteína atua como ânion.

Os aminoácidos componentes de uma proteína podem ser genericamente caracterizados se, após sua hidrólise, efetuarmos a reação da ninhidrina. A ninhidrina (hidrato de tricetoidrindeno) reage com aminoácidos produzindo cor púrpura. É uma reação inespecífica quanto à identidade do aminoácido, sendo a reação dependente da presença de grupos amina livres. O aminoácido prolina, na verdade um iminoácido, ao reagir com a ninhidrina produz coloração amarela.

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