Teste de coombs direto e indireto

Teste de coombs direto e indireto

TESTE DE COOMBS DIRETO E INDIRETO

DOENÇA HEMOLÍTICA DO RECÉM-NASCIDO

Anticorpos maternos da classe IgG podem atravessar a placenta e lesar as hemácias fetais. A doença hemolítica do recém nascido é observada com mais freqüência quando existe incompatibilidade materno-fetal quanto ao antígeno D. Assim, mulheres Rh negativas, cujos filhos são Rh positivos, podem ser imunizadas pelas células fetais, por ocasião do parto. Geralmente este primeiro filho não sofrerá ação dos anticorpos maternos, mas um segundo filho poderá ser prejudicado. Os anticorpos maternos, entrando na circulação fetal através da placenta, fixam-se às hemácias e causam destruição destas células. Para compensar a anemia resultante, a medula fetal responde excessivamente, assim como outros órgãos hematopoiéticos. Como conseqüência evidencia-se eritroblastose, anemia e hepato-esplenomegalia.

TESTE DE COOMBS

As imunoglobulinas, como outras proteínas, podem ser imunogênicas quando utilizadas para imunizar indivíduos de outras espécies. A maioria das anti-imunoglobulinas geradas desta maneira reconhecem as regiões conservadas de todos anticorpos de mesma classe. Os anticorpos anti-imunoglobulinas foram inicialmente desenvolvidos por Robin Coombs para estudar a anemia hemolítica do recém nascido e o teste para esta doença é denominado de Teste de Coombs.

Teste de Coombs direto: Neste teste anticorpos maternos que atravessaram a placenta podem ser detectados ligados nas hemácias Rh positivas do bebê. Para isso as hemácias do bebê são coletadas, lavadas para remoção de anticorpos não ligados, e simplesmente incubadas com anti-imunoglobulina humana. O teste é denominado de Coombs Direto pois a aglutinação presente vai indicar a presença dos anticorpos anti-Rh ligados nas hemácias do bebê.

PROCEDIMENTO:

-Em um tubo de ensaio adicionar 100 L de hemácias do recém nascido a ser testado, que já foram previamente lavadas para remoção de possíveis anticorpos não ligados;

-Adicionar em seguida 100L de anti-IgG humana (soro de Coombs);

-Centrifugar o tubo a 1.000rpm por 2 minutos à temperatura ambiente;

-Para visualizar com maior precisão se houve aglutinação, derramar o sangue centrifugado em uma lâmina de microscópio.

RESULTADO: Se aglutinar é sinal que o bebê já tinha anticorpos anti-D maternos da classe IgG que atravessaram a placenta e se ligaram às suas hemácias promovendo sua lise e fagocitose e haverá necessidade de transfusão sangüínea. Se não aglutinar, é porque não houve passagem de anticorpos maternos anti-D através da placenta.

Teste de Coombs indireto: Este teste é para se detectar a presença de anticorpos anti-Rh não aglutinantes no soro dos indivíduos Rh negativos. Neste teste o soro é inicialmente incubado com hemácias do tipo “O Rh positivas”, que se ligarão caso os anticorpos anti-D estejam presentes. Utiliza-se hemácias do tipo O para evitar a ligação cruzada de antígenos A ou B cujos anticorpos também podem estar presentes no soro testado (por exemplo se o indivíduo Rh negativo for do tipo sangüíneo O). Depois deste passo, as hemácias são lavadas para retirar os anticorpos não ligantes e, em seguida incubadas com anti-imunoglobulina. Este passo levará à aglutinação das hemácias indicando a positividade do ensaio. Este mesmo ensaio é feito para determinar a presença do antígeno Du.

PROCEDIMENTO:

-Em um tubo de ensaio adicionar 100 L de soro da paciente Rh negativo a ser testado,

-Adicionar em seguida 100 L de hemácias O Rh positivas;

-Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente;

-Encher o tubo com aproximadamente 2,0mL de solução salina para retirar excesso de anticorpos não ligados;

-Centrifugar o tubo a 1.000rpm por 2 minutos à temperatura ambiente;

-Desprezar o sobrenadante na pia com cuidado para não jogar fora o botão de hemácias;

-Adicionar em seguida 100L de anti-IgG humana (soro de Coombs);

-Centrifugar o tubo a 1.000rpm por 2 minutos à temperatura ambiente;

-Para visualizar com maior precisão se houve aglutinação, derramar o sangue centrifugado em uma lâmina de microscópio.

RESULTADO: Se aglutinar é sinal que a paciente tem anticorpos anti-D classe IgG em seu soro que estão de forma perigosa atravessando a placenta e se ligando às hemácias Rh positivas do bebê promovendo sua lise e fagocitose. Se não aglutinar, é porque não houve sensibilização da mãe com este antígeno em gestações ou transfusões anteriores.

PROCEDIMENTO DO COOMBS INDIRETO PARA DETERMINAR PRESENÇA DE ANTÍGENO Du (NÃO SERÁ FEITO NA AULA PRÁTICA)

  1. Em um tubo de ensaio colocar 2 gotas de hemácias diluídas a 5% em salina;

  2. Em seguida acrescentar, 2 gotas de Soro albumina bovina (BSA), utilizada para diminuir a força normal de repulsão entre as hemácias (Potencial Zeta);

  3. Em seguida acrescentar 2 gotas de anticorpo anti-D;

  4. Centrifugar este tubo a 1.000rpm por 1 minuto, agitar suavemente e observar se ocorreu aglutinação. Se for positiva, a presença de Rh positivo já está determinada. Se negativo, prosseguir o ensaio;

  5. Incubar o tubo a 37C por 5 minutos;

  6. Ao final iniciar as lavagens para a retirada dos anticorpos que não ligaram às hemácias. Para isso, acrescentar 2,0 ml de salina ao tubo e centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto;

  7. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3,0 ml de salina. Repetir a centrifugação e o passo 7 por mais duas vezes;

  8. Ao sedimento final, acrescentar 2 gotas de anti-imunoglobulina humana feita em coelhos (Soro de Coombs);

  9. Centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto;

  10. Agitar suavemente e observar se houve ou não aglutinação.

Interpretação:

Se aglutinar: Du positivo

Se não aglutinar: Rh negativo

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