Vacinas

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4Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento - n” 25- março/abril 2002

ENTREVISTAEntrevista concedida a Evanildo da Silveira

Vacina para Dengue

4Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento - n” 25- março/abril 2002

As perspectivas de uma vacina contra o virus da Dengue com a tecnologia do DNA recombinante odos os anos, algo entre 50 e 100 milhıes de pessoas no mundo contraem algum dos quatro tipos de dengue. Calcula-se que cerca de dois bilhıes de pessoas vivem em Æreas de risco da doença. Apenas em 1995, foram notificados, somente nas trŒs AmØricas, 250 mil casos de dengue, sete mil da forma grave da doença (hemorrÆgica). Segundo a Organizaçªo Mundial da Saœde, hoje as Æreas de maior risco sªo as AmØricas Central e do Sul (exceto Argentina Chile e Paraguai), MØxico, `frica, AustrÆlia, Caribe (com exceçªo de Cuba e Ilhas Caymam), China, ˝ndia e Sudeste AsiÆtico. Embora nos Estados Unidos a dengue seja rara, houve registros de alguns casos no Texas, em 1995.

No Brasil, a doença foi considerada erradicada jÆ na dØcada de 30 do sØculo passado. Na Øpoca, o combate à febre amarela levou praticamente à extinçªo do mosquito transmissor da dengue, o Aedes aegypti, vetor das duas molØstias. No entanto, em 1981, a doença voltou a fazer vítimas, principalmente na Regiªo Norte. A partir de entªo, a dengue começou a se alastrar para outras regiıes do país, notadamente as mais quentes.

As primeiras epidemias, depois do seu ressurgimento, foram registradas no Rio de Janeiro, uma em 1986-87, com cerca de 90 mil casos, e outra em 1990-91, com 100 mil. Daí em diante, o nœmero de vítimas só fez crescer. Em 1998, foram registrados, segundo o MinistØrio da Saœde, mais de 570 mil. Campanhas de conscientizaçªo da populaçªo e o trabalho do governo no combate ao mosquito transmissor reduziram o nœmero de vítimas para 210 mil, em 1999. No entanto, a queda do nœmero de casos foi passageira, pois, desde entªo, o nœmero de vítimas voltou a crescer: 240 mil em 2000 e 390.765 casos em 2001. Neste ano, só em janeiro e fevereiro, foram registrados 190.389 casos em todo o país, segundo dados da Funasa. AlØm disso, o problema se agravou recentemente por causa da introduçªo de mais um sorotipo de dengue no Brasil. Antes, só havia a dengue tipo 1 e 2, agora o 3 tambØm chegou.

A dengue Ø uma doença infecciosa causada por um arbovírus, da classe dos flavivírus (existem quatro tipos diferentes de vírus do dengue- 1, 2, 3 e 4), que ocorre principalmente em Æreas tropicais e subtropicais do mundo, como o Brasil. É transmitida principalmente por duas espØcies de mosquitos, Aedes aegypti e Aedes albopictus. As epidemias, que sªo mais comuns no verªo, estªo, atualmente, se expandindo rapidamente. A previsªo para os próximos anos Ø que aumentem em todo o planeta, principalmente nos trópicos.

Apesar do esforço de cientistas de todo o mundo, ainda nªo existem vacinas contra a doença. A forma mais eficaz de evitÆ-la, por enquanto, Ø combater os mosquitos transmisso- res. A infecçªo causada por qualquer um dos quatro tipos do vírus da dengue produz manifestaçıes semelhantes. Em mais de 95% dos casos, os sintomas sªo desconforto, febre alta, dor de cabeça e no corpo e, às vezes, vômitos.

TambØm podem aparecer, trŒs ou quatro dias após o início dos primeiros sintomas, coceira (prurido) e manchas vermelhas na pele, parecidas com as do sarampo ou rubØola. AlØm disso, Ø comum aparecer pequenos sangramentos no nariz e nas gengivas. A dengue, entretanto, raramente coloca em risco a vida da pessoa. A maioria das vítimas começa e melhorar após quatro ou cinco dias e recupera-se totalmente em cerca de dez dias.

O mØdico pernambucano Ernesto Marques, doutor em

Farmacologia e CiŒncias Moleculares pela prestigiada universidade norte-americana The Johns Hopkins University School of Medicine (JHU/SOM), de Baltimore, onde trabalha, tem um interesse pessoal em descobrir uma vacina contra a dengue. Em 1998, no Recife, viu sua mªe, na Øpoca com 60 anos, contrair dengue. Marques imaginou, entªo, que o seu interesse por vacinas de DNA, que jÆ vinha desde 1995, pudesse ajudar a combater uma doença que atinge milhıes de pessoas em todo o mundo.

Ele resolveu aproveitar sua experiŒncia com a chamada tecnologia LAMP (Lysosome Associated Membrane Protein), em vacinas de DNA, que havia sido descoberta na JHU/SOM. Meu primeiro projeto com essa tecnologia foi com HIV , lembra. Mas nªo estavÆmos progredindo muito rÆpido. Tínhamos alguns problemas que nªo estÆvamos conseguindo resolver com as nossas vacinas. Pensando sobre o assunto, achei que a dengue era um bom modelo para aplicar a tecnologia LAMP. TambØm imaginei que teria mais chance de encontrar uma vacina contra dengue do que contra HIV/AIDS.

Com sua equipe, ele começou, entªo, a trabalhar com dengue em colaboraçªo com a Marinha Americana. Foi evidente, desde o início, que estÆvamos tendo sucesso e progredíamos rÆpido , conta. Em dezembro 2000, fizemos uma descoberta que nos permitiu avançar muito em nosso programa de HIV e resolvemos, entªo, diminuir um pouco os nossos esforços com as pesquisas contra a dengue. Agora estamos trabalhando de novo, no entanto, com o mÆximo da

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"O que se espera de uma vacina contra dengue Ø que ela seja capaz de prevenir a infecçªo dos quatro sorotipos dos vírus, nªo produza efeitos colaterais, seja muito segura, nªo aumente o risco da dengue hemorrÆgica e tenha um baixo custo."

Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento - n” 25- março/abril 20025 nossa capacidade nos dois projetos.

Graduado em medicina em 1993, na

Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Marques iniciou a carreira científica no Brasil, trabalhando com Biossensores para Vitamina C e Glicose. Em 1994, ele ingressou no programa de pósgraduaçªo da JHU/SOM e em 1999, concluiu o doutorado. Fui imediatamente contratado para o corpo docente da JHU/SOM pelo Dr. Thomas August, na Øpoca chefe do departamento de Farmacologia , orgulha-se. Hoje, tenho cursos avançados em Biologia Molecular, Bioquímica, Biofísica, GenØtica, Biologia Celular, Imunologia, Virologia, BioinformÆtica entre outros.

Sua tese de doutorado envolveu a caracterizaçªo bioquímica e molecular da enzima Fucosiltransferase do Schistosoma mansoni e o desenvolvimento de inibidores para essa enzima, com o objetivo de criar uma nova droga para tratamento da esquistossomose. Publicou vÆrios trabalhos nesse campo.

Para que ele falasse sobre suas pesquisas com a vacina contra a dengue, a tecnologia LAMP e suas perspectivas, a revista Biotecnologia, CiŒncia & Desenvolvimento entrevistou o mØdico Ernesto Marques Jr., M.D./Ph.D, pesquisador associado do Departamento de Farmacologia e CiŒncias Moleculares, da Johns Hopkins University School of Medicine.

BC&D - Desde quando o senhor estÆ pesquisando uma vacina para a dengue?

Ernesto Marques - Desde o final de 1998, começo de 1999

BC&D - Como surgiu o seu interesse por uma vacina para essa doença?

Ernesto Marques - Bem, a idØia surgiu principalmente por conseqüŒncia da epidemia que estÆ ocorrendo no Brasil, inclusive atØ alguns familiares meus a tiveram tambØm.

BC&D - O senhor poderia explicar o que Ø a tecnologia Naked DNA ?

Ernesto Marques - É uma resposta longa, mas, de forma bastante simplificada, eu diria que o termo Naked DNA surgiu no início dos anos 90. Ele refere-se ao uso de DNA puro na forma de plasmídeos (vetores de expressªo de proteínas) em cØlulas de animais, sem o uso de nenhum agente para revestir o DNA - por isso chamado de Naked (nu, despido). A grande surpresa foi a capacidade destes plasmídeos entrarem dentro das cØlulas dos animais vivos e produzirem a proteína codificada por eles (plasmídeos) sem a ajuda de um vetor. Como vacinas, de um modo geral, funcionam induzindo uma resposta imunológica contra antígenos - que sªo proteínas na maioria das vezes - se pensou, imediatamente, em aplicar esta tecnologia para desenvolvŒ- las. Hoje, com as tecnologias de engenharia genØtica Ø fÆcil construir plasmídeos capazes de sintetizar a proteína (antígeno) que se deseja. Um dos grandes contribuidores para o avanço das tecnologias de engenharia genØtica foi o Dr. Daniel Natans, nosso professor aqui na JHU e laureado com o prŒmio Nobel de Medicina, em 1978, devido às suas descobertas de enzimas de restriçªo, que foram a base da engenharia genØtica.

BC&D - O senhor poderia explicar a estratØgia LAMP ? O que ela significa? Como funciona?

Ernesto Marques - LAMP Ø a abreviaçªo de Lysosome Associated Membrane Protein . LAMP Ø uma proteína das nossas cØlulas que se localiza especificamente nos lisossomos, que sªo organelas celulares especializadas na digestªo celular. A estratØgia LAMP , se refere ao uso de uma pequena porçªo da proteína LAMP, que Ø responsÆvel pela localizaçªo da mesma nos lisossomos, Ø um sinal de trÆfego celular . Nós utilizamos este sinal de trÆfego celular da proteína LAMP e o colocamos em outras proteínas para fazer com que elas tambØm se dirijam aos lisossomos. No caso da vacina para dengue, colocamos o sinal LAMP na proteína do envelope do vírus da dengue e a fizemos se dirigir para o lisossomo. A vantagem de se colocar proteínas antigŒnicas direto no lisossomo Ø que, em certas cØlulas especializa- das do sistema imune (cØlulas apresentadoras de antígenos, como as cØlulas dendríticas), os lisossomos sªo o centro de processamento dos antígenos. Ou seja, o direcionamento ao lisossomo torna os antígenos muito mais visíveis ao sistema imune e, portanto, às vacinas mais eficientes.

BC&D - O senhor poderia explicar o que Ø exatamente o sinal de trÆfego celular da proteína LAMP? O que Ø o trÆfego celular ?

Ernesto Marques - As cØlulas possuem vÆrios compartimentos bem organizados que tŒm funçıes bem específicas e sªo chamados de organelas. As cØlulas transportam materiais entre estes compartimentos para serem processados. É como nós fazemos na indœstria, por exemplo. AlguØm coleta o minØrio de ferro e pıe no caminhªo para ser levado à usina siderœrgica. Na usina, eles fabricam o aço e o mandam para a indœstria automobilística. E assim por diante. Quando o material Ø transportado de um local para o outro, vocŒ deve pôr o endereço do destinatÆrio. As cØlulas tŒm sistemas similares. Os sinais de trÆfego celulares sªo indicadores que determinam este endereçamento dentro da cØlula. O sinal celular da LAMP, portanto, Ø o sinal que determina que LAMP vai ser transportada ao compartimento endossomo/lisossomo (endossomo Ø organela, mais ou menos como o lisossomo).

BC&D - Por que o senhor achou que dengue era um bom modelo para aplicar a tecnologia LAMP?

Ernesto Marques - Por vÆrias razıes. Uma Ø que, quando uma pessoa se infecta com dengue, geralmente se cura e nªo pega mais a dengue do mesmo sorotipo, só de outro. O que significa que a pessoa se torna imune. Isto nªo acontece com outras doenças, como Ø o caso de HIV. Outra razªo, Ø que se sabe quais sªo os mecanismos imunológicos que tornam a pessoa resistente ao vírus e se tem maneiras de testar a vacina em animais e saber se ela dÆ proteçªo ou nªo. No caso especifico do uso de LAMP, a vantagem Ø que o antígeno principal da dengue Ø uma proteína de membrana como LAMP e o trÆfego celular funciona sem complicaçıes.

BC&D - Como o sinal de trÆfego celu-

6Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento - n” 25- março/abril 20026Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento - n” 25- março/abril 2002 lar Ø colocado em outras proteínas?

Ernesto Marques - O sinal de trÆfego celular de LAMP se constitui em uma seqüŒncia específica de aminoÆcidos, que determina o endereçamento celular. Por tØcnicas de biologia molecular e engenharia genØtica nós podemos construir proteínas quimØricas, compostas por partes de vÆrias proteínas diferentes, colocando nestas quimeras o sinal que as endereça ao endossomo/lisossomo. No caso da vacina contra a dengue fizemos uma quimera com uma parte da proteína do envelope do vírus da dengue e uma outra parte com o sinal de trÆfego celular de LAMP, para direcionar ao endosomo/lisossomo.

BC&D - O que significa alterar o trÆfego do envelope da dengue ?

Ernesto Marques - A proteína envelope normalmente nªo Ø levada ao lisossomo, mas quando nós colocamos o sinal LAMP ela passa a ser. E isto Ø que leva a vacina envelope/LAMP quimera a ser mais imunogŒnica.

BC&D - O que vem a ser o envelope da dengue ?

Ernesto Marques - Alguns vírus sªo revestidos por uma membrana, como Ø o vírus da dengue, e esta membrana, junto com as proteínas que estªo nela, Ø chamada de envelope. Estes vírus, para serem capazes de penetrar e infectar outras cØlulas, geralmente precisam se reconhecer e fundir-se a cØlulas especificas. Isto Ø mediado atravØs das proteínas virais específicas que se localizam no envelope. O vírus da dengue só tem uma proteína (viral) no envelope (que Ø conhecida como envelope, que contØm um fragmento chamado prØ-membrana) mas outros vírus possuem mais. A existŒncia destas glico-proteínas virais de membrana foi inicialmente identificada por Dr. Thomas August and Dra. Mette Strand, que foram orientadores da minha tese no doutorado.

BC&D - Sua vacina Ø o que se pode chamar de vacina gŒnica ?

Ernesto Marques - Sim, eu diria que o uso de DNA ou RNA como vacina Ø o que caracteriza uma vacina gŒnica. O uso do DNA recombinante abre um leque infinito de possibilidades. Neste caso, nós usamos uma porçªo do LAMP para alterar o trÆfego do envelope da dengue. Mas existem outras coisas que podemos fazer.

BC&D - Por exemplo?

Ernesto Marques - Associar molØculas que sªo estimuladoras do sistema imunológico como, GM-CSF ou IL-2, epitopos específicos, sinais do sistema imune nativo etc.

BC&D - HÆ o risco desse DNA, usado nas vacinas, incorporar-se ao genoma das pessoas vacinadas e alterÆ-lo?

Ernesto Marques - Isto tem sido investigado exaustivamente e atØ agora nªo se conseguiu nenhuma evidŒncia de que isto esteja ocorrendo.

BC&D - Por que essa certeza?

Ernesto Marques - VÆrios testes de Vacinas de DNA jÆ foram feitos, em diversas espØcies de animais e tambØm em humanos, e após algumas semanas de vacinaçªo, o DNA da vacina nªo foi mais encontrado nos tecidos do vacinados por nenhuma das tØcnicas mais sensíveis que conhecemos.

BC&D - A vacina que o senhor desenvolve usa vírus atenuado ou vivo?

Ernesto Marques - Ela nªo usa vírus atenuado ou vivo. Os vírus, sªo agentes vivos, que infectam as cØlulas, se replicam e infectam mais cØlulas. Os vírus tambØm tem o seu material genØtico (RNA ou DNA) e suas próprias proteínas. O plasmídeo, Naked DNA , nªo carrega consigo nenhuma proteína e só tem uma pequena fraçªo do material genØtico do vírus. Nªo Ø capaz de se reproduzir nas cØlulas humanas ou transfectar novas cØlulas.

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