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SUMÁRIO

SUMÁRIO 3

1 INTRODUÇÃO 4

2 MÉTODOS FOTOMÉTRICOS 5

2.1 Luz 5

2.2 Interação da luz com a matéria 7

3 FOTOMETRIA 9

3.1 Transmitância 10

CONCEITO IMPORTANTE PARA A LEI DE LAMBERT-BEER 10

CROMÓFORO 10

4 LEI DE LAMBERT-BEER 11

4.1 Determinações simultâneas 13

4.3 Fluorescência 14

4.4 Métodos fotométricos na análise qualitativa 15

4.5 Métodos fotométricos na análise quantitativa 15

5 ESPECTROFOTOMETRIA 15

5.1 Tipos de Espectrofotometria 18

5.2 Espectrofotometria astronômica 18

5.3 Espectrofotometria de absorção atômica 19

5.4 Espectrofotometria no Infra-vermelho 19

5.5 Equipamento 20

5.5.1 Espectrofotômetro 20

5.5.2 Fonte 21

5.5.3 Seleção do Comprimento de Onda (l) 21

5.5.4 Fendas e lentes 22

5.5.5 Cubeta 22

5.5.6 Detectores 22

5.5.7 Fluorímetro 24

CONCLUSÃO 24

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 26

1 INTRODUÇÃO

A espectrofotometria é o método de análises óptico mais usado nas investigações biológicas e fisico-químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância.

Todas as substâncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visível. A água absorve fortemente na região do infravermelho. A absorção das radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem das estruturas das moléculas, e é característica para cada substância química.

Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida (absorbância): a energia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida. A cor das substâncias se deve a absorção (transmitância) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas não absorvidos.

A fotometria é o ramo da óptica que se preocupa em medir a luz, em termos de como seu brilho é percebido pelo olho humano. Aquela se diferencia da radiometria, que é a ciência que mede a luz em termos de sua potência absoluta, por descrever a potência radiante associada a um dado comprimento de onda usando a função de luminosidade modeladora da sensibilidade do olho humano ao brilho. A fotometria também é utilizada na astronomia, na observação de estrelas, pela percepção da diminuição da luz por elas emitida. Através de estudos e cálculos, é possível descobrir novos planetas e saber informações como rotação, translação, distância da estrela e satélites.

Neste trabalho, trataremos dos métodos analíticos baseados na absorção de radiação eletromagnética. A luz tem radiações para as quais a vista humana é sensível, e as ondas com comprimento de onda diversos provocam sensações de cores diferentes; uma mistura apropriada da luz, com estes comprimentos de onda, constitui a luz branca.

2 MÉTODOS FOTOMÉTRICOS

De acordo com o senso comum, quanto mais cromóforo (substância que absorve luz) uma solução tiver, mais escura ela será. Todo dia inferimos a quantidade de café pela aparência do cafezinho! No início, a fotometria utilizou exatamente este instrumento, ou seja, o olho humano, para determinar a concentração de substâncias cromóforas. Para facilitar esta tarefa, uma vez que o nosso olho não é um equipamento absoluto, usou-se cores ou concentrações padrões com os quais a solução em análise poderia ser comparada. A precisão deste método, porém, não era adequada devido às propriedades da visão e também do componente subjetivo, que sempre que possível deve ser eliminado na quantificação. O advento de equipamentos capazes de quantificar a luz permitiu que a quantidade de fótons pudesse ser medida, permitindo uma quantificação muito mais precisa.

Antes de abordar os aparelhos responsáveis pelas medidas fotométricas, é importante discutir um pouco as bases teóricas que permitem a aplicação da absorção da luz como método quantitativo.

2.1 Luz

A luz é uma onda eletromagnética, isto é, possui dois componentes, um componente elétrico

e outro magnético, posicionados a um ângulo de 90º um em relação ao outro.

Todo movimento oscilatório possui um comprimento de onda, que é a distância entre dois

máximos de onda. Na Figura 1 podemos ver uma onda com um comprimento de 360 e outro de

200 nm. A amplitude da onda ( neste exemplo de 1,0 e 0,6) representa a intensidade da mesma.

Outra propriedade muito importante das ondas é que elas podem interagir umas com as outras. No exemplo da figura 1, as duas ondas na realidade se somam para produzir a onda marcado com SOMA. Este efeito de soma das ondas é particularmente importante no que se refere à interferência entre ondas, que, quando defasadas em p se anulam completamente (interferência destrutiva) e quando não possuírem defasagem (ou obviamente defasagem de 360, 720º) se soma (interferência construtiva). Basta lembrar que a diferença entre uma luz normal e um laser é a interferência, que é construtiva neste e tanto construtiva como destrutiva naquele.

O comprimento de onda (l) se relaciona com as outras propriedades das ondas através

das seguintes equações:

“c” é a velocidade da luz no vácuo (~ 3 x 108 m s-1), n é a frequência em s-1, E a energia em Joules e h a constante de Plank (6,6 x 10-34 J s).

Estas duas equações indicam que tanto a frequência como a energia é inversamente proporcional ao comprimento de onda. Desta forma, ondas mais energéticas tem um λ menor e uma frequência maior. As ondas eletromagnéticas, dependendo da sua energia, possuem características diferentes, principalmente no que se refere a sua interação com a matéria, sendo utilizados para os mais diversos fins. É importante salientar que as propriedades de ondas eletromagnéticas (i. e. velocidade, interferência) permanecem inalteradas por todo o espectro de energia. A Figura 2 mostra o espectro de ondas eletromagnéticas, que vão desde l de quilômetro até fentometros (10-15).

As ondas eletromagnéticas que podem ser detectadas por nossos olhos, isto é, o visível, ocupa uma pequena faixa de todo o espectro. Dentro do visível, como bem sabemos, existem várias cores, que nada mais são do que ondas com diferentes λs. As energias, as frequências e os comprimentos de onda das cores são mostrados na Tabela 1.

Figura 2. Ondas eletromagnéticas de diferentes energias.

Cor Cor Complementar /nm /(1014 Hz)

Ultravioleta (UV) <380 7,89

Violeta Verde-amarelado 380-435 7,89-6,90

Azul Amarelo 435-480 6,90-6,25

Azul-esverdeado Alaranjado 480-490 6,25-6,12

Verde-Azulado Vermelho 490-500 6,12-6,00

Verde Púrpura 500-560 6,00- 5,36

Verde-amarelado Violeta 560-580 5,36-5,17

Amarelo Azul 580-595 5,17-5,04

Alarajado Azul-esverdeado 595-650 5,04-4,62

Vermelho Verde-azulado 650-780 4,62-3,85

Infravermelho (IV) > 780 3,85

2.2 Interação da luz com a matéria

Radiações eletromagnéticas interagem com a matéria de muitas formas. Como trataremos somente das radiações no visível e das radiações com energias próximas a este, como o UV e o IV, serão analisadas somente as interações que as radiações eletromagnéticas desta faixa de energia produzem.

Para podermos compreender a interação da luz com a matéria é necessário fazer uma rápida revisão sobre a constituição da matéria. Como todos sabem os átomos e, portanto as moléculas são constituídas por um núcleo (prótons + nêutrons) e por elétrons. As energias das radiações eletromagnéticas na faixa do visível não possuem energia suficiente para alterar os núcleos λ, podendo alterar somente as distribuições eletrônicas dos átomos e das moléculas. É interessante lembrar que os elétrons são distribuídos em orbitais preenchidos segundo as regras de distribuição eletrônica de Pauling.

Um átomo ou molécula possuem orbitais ocupados e orbitais não ocupados. No estado fundamental os elétrons se distribuem de forma a minimizar a energia. Existe, porém, a possibilidade de ocupação de orbitais mais energéticos, se for proporcionada certa quantidade de energia.

Isto pode acontecer quando um fóton de luz atingir um átomo ou molécula como visto na Figura 3.

Figura 3. Orbitais eletrônicos e a absorção e emissão de luz

Este elétron no estado excitado tenderá a voltar para o estado fundamental, o que geralmente ocorre por um caminho tortuoso, na qual o elétron passa para um estado metaestável, emitindo com isso energia térmica, e deste estado volta ao estado fundamental, emitindo luz.

Esta emissão de luz é classificada como fluorescência quando a emissão cessa logo após a extinção da excitação e fosforescência quando a emissão espontânea continua por períodos de tempo mais elevados (até mesmo horas, mas caracteristicamente segundos ou frações de segundos).

Uma característica muito importante a que deve ser considerada quando se leva em consideração estas transições energéticas entre orbitais é a quantização.

As transições só ocorrem quando a energia fornecida pela radiação é igual à energia de transição entre os dois orbitais, sendo que tanto energias inferiores como superiores são incapazes de produzir a transição eletrônica.

Figura 4. Espectro de absorção de vários pigmentos fotossintéticos.

(Absorbância x Comprimento de onda)

As transições energéticas que ocorrem em um átomo ou molécula podem ser determinadas através de um espectro de absorbância, que é a medição da quantidade de luz absorvida em vários λs, como visto na Figura 4.

É interessante ressaltar que é justamente nestas transições eletrônicas que está o motivo do mundo colorido que vivenciamos. Vejamos o caso da clorofila, que como todos sabemos é responsável pelo maravilhoso verde das matas, possui uma forte absorção na região do azul e do vermelho. Isto significa dizer que quando olhamos para uma folha, estamos recebendo em nossos olhos a luz filtrada, isto é, a luz branca (que possui todos os λs) subtraídos do azul e do vermelho (Figura 4), fazendo com que somente o que não for absorvido seja captado pelos nossos olhos, isto é, o verde (λ = 530). Da mesma forma, todas as colorações que vemos são resultado da absorção seletiva de algum l, restando a cor. Neste ponto é interessante filosofar que pode ter havido uma pressão seletiva durante a evolução dos órgãos responsáveis pela detecção da luz (leia-se olhos) para que fossem detectados justamente os s entre 400 e 700nm, pois esta região é riquíssima em transições observadas na natureza, trazendo desta forma uma quantidade de informações imensa (muito provavelmente o mundo em λ diferentes do visível seja bastante “cinza” ou monótono - isto é, contém muito menos informação).

3 FOTOMETRIA

Fotometria é a medida da luz proveniente de um objeto. Até o fim da Idade Média, o meio mais importante de observação astronômica era o olho humano, ajudado por vários aparatos mecânicos para medir a posição dos corpos celestes. Depois veio a invenção do telescópio, no começo do século XVII, e as observações astronômicas de Galileo. A fotografia astronômica iniciou no fim do século XIX e durante as últimas décadas muitos tipos de detectores eletrônicos são usados para estudar a radiação electromagnética do espaço. Todo o espectro electromagnético, desde a radiação gama até as ondas de rádio são atualmente usadas para observações astronômicas.

Apesar de que observações com satélites, balões e espaçonaves podem ser feitas fora da atmosfera, a grande maioria das observações é obtida da superfície da Terra.

Como a maioria das observações utiliza radiação electromagnética, e podemos obter informações sobre a natureza física da fonte estudando a distribuição de energia desta radiação, introduziremos alguns conceitos para a caracterização desta radiação.

  •   comprimento de onda

  •   freqüência

  • c 300 000 km/s  velocidade da luz

Localização no espectro:

A radiação visível vai aproximadamente de 3900 Å (violeta) até cerca 7800 Å (vermelho).

Cor

Comprimento de onda (Å)

Freqüência (1012 Hz)

Violeta

3900 - 4550

659 - 769

Azul

4550 - 4920

610 - 659

Verde

4920 - 5770

520 - 610

Amarelo

5770 - 5970

503 - 520

Laranja

5970 - 6220

482 - 503

Vermelho

6220 - 7800

384 - 482

Freqüências e comprimentos de onda para várias cores, no vácuo. Como as cores são subjetivas, pois dependem da sensibilidade de cada olho humano, a definição é um pouco arbitrária.

3.1 Transmitância

Se passarmos um feixe de luz de intensidade conhecida (Io) através de uma amostra e medirmos a intensidade da luz que emergiu (I), podemos calcular a transmitância (T) desta amostra da seguinte forma: T = I / Io , isto é, a razão de luz que atravessa a

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