Apostila de biologia molecular

Apostila de biologia molecular

(Parte 1 de 5)

Sandra Regina Ceccato Antonini Silvana Perissatto Meneghin

Alfredo Seiiti Urashima

COORDENADORES

• Profª Sandra Regina Ceccato Antonini – Doutora no Depto.Tecnologia

Agroindustrial e Sócio-economia Rural, CCA/UFSCar, com pós-doutorado em genética molecular de leveduras na Universidade de Sheffield, Inglaterra.

• Profª Silvana Perissatto Meneghin – Assistente no Depto.

Biotecnologia Vegetal, CCA/UFSCar, doutoranda em Microbiologia.

• Prof. Alfredo Seiiti Urashima - Doutor no Depto. Biotecnologia

Vegetal, CCA/UFSCar, com pós-doutorado em fitopatologia e biologia molecular na Universidade de Kobe, Japão.

Esta apostila se refere ao curso de extensão universitária “Técnicas básicas de biologia molecular”, oferecido no período de 12 a 16 de julho de 2004, no Laboratório de Microbiologia Agrícola e Molecular (LAMAM), Depto. Biotecnologia Vegetal / Depto. Tecnologia Agroindustrial e Sócio-Economia Rural, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de São Carlos.

Endereço:LAMAM - UFSCar

e-mail: lamam@cca.ufscar.br

2 INDICE

5. Quantificação de DNA…………………………………………………26
6. Reação PCR……………………………………………………………29

1. Introdução………………………………………………………………… 03 2. Segurança no laboratório e disposição de resíduos perigosos…… 03 3. Introdução à biologia molecular e marcadores moleculares……….. 05 4. Extração de DNA genômico total…………………………...………….. 24 7. Polimorfismo por RAPD………………………………………………… 3 8. Polimorfismo por RFLP………………………………………………… 37 9. Análise dos resultados………………………………………………… 45 10. Bibliografia………………………………………………………………. 48 1. Preparo de soluções…………………………………………………… 49

1. INTRODUÇÃO

Há várias técnicas em biologia molecular usadas numa ampla variedade de estudos tais como genética de populações, estudos sobre evolução ou filogenia, mapeamento e expressão gênica. Fica difícil cobrir as técnicas exatas em cada uma das áreas de estudo mas estas técnicas se desenvolveram a partir de métodos básicos. O objetivo desse curso é introduzir os alunos às técnicas básicas como PCR e suas variações, como RAPD, e também RFLP, discutindo que condições afetam essas técnicas, os cuidados, a forma de avaliação dos resultados e as aplicações nos mais diversos campos do conhecimento.

2. SEGURANÇA NO LABORATÓRIO E DISPOSIÇÃO DE RESÍDUOS PERIGOSOS

Durante o trabalho experimental, trabalhar-se-á com reagentes potencialmente perigosos e equipamentos, sendo necessário adotar procedimentos de segurança no laboratório.

Segurança no laboratório

1. É proibido comer, beber, fumar, estocar alimentos e usar cosméticos no laboratório.

2. Devem ser usados sapatos adequados, fechados, e com sola não deslizante em todas as áreas do laboratório.

3. Cabelos longos devem estar presos.

4. Jalecos devem ser usados para a proteção contra contaminação ou danos às roupas. Eles devem ser removidos ao deixar as áreas do laboratório para evitar transferência de contaminantes do laboratório para as áreas normalmente limpas (como escritórios, copas, etc.)

5. As mãos devem ser lavadas depois da retirada das luvas, antes de deixar o laboratório, e a qualquer tempo depois do manuseio de materiais tidos como suspeitos de contaminação.

6. A proteção da face e dos olhos (usando óculos,visores ou outros equipamentos de proteção) deve ser feita, para evitar o impacto de objetos, substâncias prejudiciais, luz ultravioleta ou outras radiações.

7. Pipetar qualquer substância com a boca é proibido.

Disposição de resíduos perigosos

Resíduos biológicos perigosos A definição de resíduos biológicos perigosos (‘biohazard’) é ‘qualquer material que está ou esteve em contato com carcaça de animais e/ou produtos animais’. Isto inclui todos os resíduos associados com procedimentos microbiológicos (bactérias e vírus) e qualquer item que esteve em contato com enzimas e DNA recombiante. Portanto, a maioria das ponteiras e tubos são perigosos (‘biohazardous’). Todos os materiais líquidos e sólidos contaminados ou infectados devem ser autoclavados por 40 minutos antes de serem dispostos ou reutilizados.

Resíduos orgânicos Solventes orgânicos como fenol, clorofórmio e álcool isoamílico não devem ser despejados na pia. A maioria dos materiais contaminados com solventes orgânicos devem ser colocados num recipiente reforçado. Quando estes recipientes estiverem cheios, devem ser encaminhados ao serviço de coleta especializado.

Brometo de etídio Os materiais contaminados com brometo de etídio (luvas, ponteiras, tubos e géis) devem ser colocados num recipiente reforçado e dispostos como os resíduos orgânicos. A disposição de solução de brometo de etídio com concentração inferior a 0,5 µg/mL pode ser feita da seguinte maneira:

- acrescentar 1 g de carvão ativado por litro de solução

- agitar por 1 hora a temperatura ambiente

- filtrar usando papel de filtro Whatman no. 1 e dispor como sólido contaminado com luvas, ponteiras, etc.

Outras soluções Soluções solúveis em água, não perigosas, podem ser despejadas na pia.

3. INTRODUÇÃO À BIOLOGIA MOLECULAR E MARCADORES MOLECULARES

Entre todas as propriedades dos organismos vivos, a capacidade de auto-replicação é fundamental. Conter a informação genética significa não somente armazenar e transmitir ao longo das gerações, mas expressar, ou seja, servir de molde para a síntese de RNAs e alguns desses serem traduzidos nas proteínas correspondentes. Com o desenvolvimento técnico, vários avanços significativos têm sido obtidos através do isolamento, análise e síntese de seqüência de DNA e genes, e da introdução desses DNAs recombinantes em células vivas para o estudo da sua função e dos mecanismos que controlam sua expressão. Atualmente, os esforços estão voltados para o entendimento das relações entre ácidos nucléicos e proteínas que resultam em, virtualmente, todos os eventos genéticos na célula.

Estrutura do DNA

O material genético de toda a vida neste planeta é formado por apenas seis componentes. Esses componentes são: uma molécula de açúcar

(desoxirribose), um grupamento no fosfato e quatro bases nitrogenadas diferentes: adenina, guanina, citosina e timina. A unidade essencial que forma a molécula do DNA é chamada nucleotídeo que mais precisamente, desoxinucleotídeo. Um desoxinucleotídeo consiste em uma molécula de desoxirribose com um fosfato ligado em uma posição e uma das quatro bases nitrogenadas ligada à outra posição. Os átomos de carbono da porção açúcar desoxirribose de um nucleotídeo são sempre numerados do mesmo modo. A base está sempre ligada ao carbono 1 e o grupamento fosfato está sempre ligado ao carbono 5 (Figura 1).

Na molécula do DNA, milhares ou milhões destes nucleotídeos estão agrupados em uma cadeia, pela união do grupamento fosfatos, ligados ao carbono número 5 de uma molécula desoxirribose, com o carbono número 3 de uma segunda molécula de desoxirribose (uma molécula de água é liberada no processo). As ligações formadas entre as moléculas de desoxirribose, através do grupamento fosfato, são chamadas ligações fosfodiéster. Como os nucleotídeos são unidos por ligações entre seus grupamentos açúcar e fosfato, freqüentemente é dito que o DNA possui um esqueleto de açúcar-fosfato

(Figura 2).

O esqueleto açúcar-fosfato do DNA é um elemento estrutural importante, mas toda a informação está contida nas quatro bases nitrogenadas. A chave para a transmissão da informação genética reside em uma característica dessas bases: adenina e timina juntas formam um par químico estável e citosina e guanina formam um segundo par estável. Os pares são formados de interações químicas fracas, chamadas pontes de hidrogênio. Estes dois pares, adenina-timina e citosina-guanina, são chamadas pares de bases complementares.

Na molécula de DNA, dois esqueletos açúcar-fosfato permanecem lado a lado, uma fita disposta da extremidade 5 para a extremidade 3 e a outra disposta da extremidade 3 para 5. As bases ligadas a uma fita estão pareadas com suas bases complementares, ligadas à fita oposta. Assim, a seqüência de bases específicas em uma fita é refletida perfeitamente na seqüência das bases complementares na outra fita. O conhecimento da seqüência de bases de uma fita nos permite deduzir a seqüência de bases na fita complementar.

O DNA é geralmente representado como uma molécula plana, já que esta forma é mais fácil tanto para representar quanto para analisar. Na realidade, cada um dos dois esqueletos açúcar-fosfato é enrolado ao redor do outro, em uma conformação chamada dupla hélice. Os pares de bases ficam voltados para a face interna da hélice, como os degraus de uma escada. Para facilitar a representação e visualização, o DNA pode ser apresentado por um modelo no qual cada esqueleto é representado como uma fita delgada e os pares de base são representados esquematicamente. Na verdade, como a seqüência de nucleotídeos de uma fita, uma molécula de DNA ou uma região de uma molécula é freqüentemente representada pela seqüência de apenas uma fita, sempre escrita na direção de 5 para 3.

Função do DNA: replicação fiel

A estrutura do DNA sugere imediatamente como o DNA cumpre a primeira função crítica do material genético: a replicação fiel. Você pode observar que qualquer uma das duas fitas do DNA pode ser usada como um molde, ou padrão, para reproduzir a fita oposta, por meio do uso das regras de pareamento de bases complementares. Quando uma célula está pronta para replicar seu material genético, as duas fitas opostas são gradualmente “desenroladas”, expondo as bases individualmente. Cada fita, então, é usada como um molde para síntese de duas novas fitas. O resultado é duas moléculas de DNA filhas, cada uma composta por uma fita original e uma fita recém-sintetizada, e cada nova molécula de DNA é idêntica à molécula de DNA original.

Como ocorre a replicação do DNA na célula? O DNA é duplicado por enzimas, as proteínas que servem como cavalos de batalha das células. Enzimas celulares especializadas trabalham juntas para desenrolar a dupla hélice do DNA, capturar nucleotídeos livres, parear os novos nucleotídeos corretos com a fita-molde e formar as novas ligações do esqueleto açúcarfosfato em crescimento. O componente principal deste conjunto de proteínas é chamado DNA polimerase. Esta é a enzima que, de fato, faz o correto pareamento das bases e forma as novas ligações fosfodiéster. Finalmente, algumas das enzimas de replicação do DNA “conferem” a nova fita de DNA, chegando erros no pareamento de bases e corrigindo quaisquer erros que tenham encontrado. Estas cuidadosas enzimas asseguram que muito poucos erros ocorram durante a replicação do DNA, de modo que a informação genética seja transmitida corretamente (Figura 3).

Função do DNA: transmissão da informação.

Embora a estrutura do DNA sugira imediatamente como a molécula pode, pela duplicação, transmitir fielmente a informação genética, não é tão óbvio como uma molécula tão simples pode determinar o desenvolvimento de criaturas tão complexas e variadas quanto uma baleia azul ou uma rosa. Para entender como a estrutura do DNA elegantemente cumpre esta exigência, é necessário pensar sobre o que faz uma baleia ser uma baleia ou uma rosa ser uma rosa.

O que faz uma baleia ser uma baleia? A resposta é: suas proteínas.

tijolos e o cimento de sua pele, músculos, órgãos e tecidos; outrasproteínas

Assim como as proteínas cumprem a complicada tarefa de duplicar o DNA da baleia, outras proteínas cumprem praticamente todas as outras funções necessárias para a sobrevivência da baleia. Proteínas estruturais formam os sintetizam componentes estruturais adicionais, como ossos e lipídeos. Proteínas transportadoras conduzem oxigênio, nutrientes, hormônios e outras moléculas importantes através de seu corpo e entre suas células. Receptores protéicos embebidos nas superfícies celulares, ligam com grande especificidade, os hormônios da baleia, permitindo que ela cresça e se desenvolva adequadamente. Proteínas do sistema imunológico da baleia defendem-na de infecções. Proteínas catalisadoras (enzimas) digerem seus alimentos, sintetizam as gorduras que a baleia armazena, replicam seu DNA para transmissão aos filhotes e executam todas as outras tarefas metabólicas necessárias para a sobrevivência das células da baleia. Assim, as proteínas fornecem a estrutura e desempenham as funções vitais da baleia. O mesmo é verdadeiro para uma rosa, uma mosca-da-fruta, uma bactéria, um ser humano e qualquer outra forma de vida na Terra.

Não é simplesmente a natureza das proteínas de um organismo que lhe dá uma identidade particular. Afinal, as proteínas de diferentes animais podem ser muito similares – proteínas musculares, hemoglobina, enzimas de replicação do DNA e assim por diante. As proteínas de animais estreitamente relacionados podem ser muito semelhantes. Mesmo organismos tão diferentes quanto animais e plantas possuem alguns tipos de proteínas em comum.

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