APOSTILA - Cromatografia em Coluna

APOSTILA - Cromatografia em Coluna

Universidade Federal de Goiás

Instituto de Química Laboratório de Preparações

Cromatografia em Coluna (C)

Bruna Ferreira Silva.
Larissa Carvalho Silva.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Morais Lião. Acadêmicos: Eli Silveira Ales Júnior. Goiânia, de maio de 2009.

Será abordada neste relatório a aula de Cromatografia em Coluna tendo como adsorvente sílica em gel; aula realizada no dia 27 de abril de 2009 sob a orientação do Prof. Dr. Luciano Morais Lião.

Introdução:

Cromatografia é uma técnica utilizada para analisar, identificar ou separar os componentes de uma mistura. A cromatografia é definida como a separação de dois ou mais compostos diferentes por distribuição entre fases, uma das quais é estacionária e a outra móvel. Introduzida pelo pesquisador russo Michael Tswett em 1906, quando separou clorofila de uma mistura de pigmentos de plantas, através de uma coluna cheia de carbonato de cálcio em pó, fazendo a lavagem com éter de petróleo. Conforme a amostra descia pela coluna, apareciam bandas separadas e cores distintas. Palavra de origem grega, onde “cromo” significa cor e “grafia” significa escrita, ou seja “escrita em cores”. Mas a cromatografia pode separar os componentes sem nenhum aparecimento de cor.

A cromatografia é preliminarmente uma ferramenta analítica para a separação de misturas, combinada com análises qualitativas e quantitativas das substâncias separadas. É uma poderosa e muito usada técnica de separação dos componentes de uma amostra.

Os componentes das amostras são distribuídos entre duas fases, uma das quais permanece estacionária, enquanto a outra elui entre os interstícios ou sobre a superfície da fase estacionária. O movimento da fase móvel resulta numa migração diferencial dos componentes da amostra. O mecanismo envolvido nesta migração diferencial vai depender do tipo da fase móvel e estacionária utilizado. Pela escolha apropriada da fase fixa e da fase móvel, além de outras variáveis, pode-se fazer com que os componentes da mistura sejam arrastados ordenadamente. Aqueles que interagem pouco com a fase fixa são arrastados facilmente e aqueles com maior interação ficam mais retidos.

Os componentes da mistura adsorvem-se com as partículas de sólido devido a interação de diversas forças intermoleculares. O composto terá uma maior ou menor adsorção, dependendo das forças de interação, que variam na seguinte ordem: formação de sais > coordenação > pontes de hidrogênio > dipolo-dipolo > Van der Waals.

Dependendo da natureza das duas fases envolvidas tem-se diversos tipos de cromatografia:

- sólido-líquido (coluna, camada fina, papel);

- líquido-líquido;

- gás-líquido.

Os métodos cromatográficos possuem uma faixa de aplicação ilimitada. Podem ser usadas para separação de moléculas menores, como H2 e D2, até as maiores, como proteínas etc. Quantidades na ordem de picogramas podem ser separadas e detectadas por cromatografia gasosa combinada com espectrometria de massa, e quantidades em multigramas podem ser separados e isolados por métodos de coluna preparativa.

A cromatografia em coluna é uma técnica de partição entre duas fases, sólida e líquida, baseada na capacidade de adsorção e solubilidade. O sólido deve ser um material insolúvel na fase líquida associada, sendo que os mais utilizados são a sílica gel (SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de pó. A mistura a ser separada é colocada na coluna com um eluente menos polar e vai-se aumentando gradativamente a polaridade do eluente e conseqüentemente o seu poder de arraste de substâncias mais polares. Uma seqüência de eluentes normalmente utilizada é a seguinte: éter de petróleo, hexano, éter etílico, tetracloreto de carbono, acetato de etila, etanol, metanol, água e ácido acético.

O fluxo de solvente deve ser contínuo. Os diferentes componentes da mistura mover-seão com velocidade distintas dependendo de sua afinidade relativa pelo adsorvente(grupos polares interagem melhor com o adsorvente) e também pelo eluente. Assim, a capacidade de um determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase diretamente da polaridade do solvente com relação ao composto.

À medida que os compostos da mistura são separados, bandas ou zonas móveis começam a ser formadas; cada banda contendo somente um composto. Em geral, os compostos apolares passam através da coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os primeiros têm menor afinidade com a fase estacionária. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura, ela não se moverá. Por outro lado, se for escolhido um solvente muito polar, todos os solutos podem ser eluídos sem serem separados. Por uma escolha cuidadosa das condições, praticamente qualquer mistura pode ser separada

Outros adsorventes sólidos para cromatografia de coluna em ordem crescente de capacidade de retenção de compostos polares são: papel, amido, açucares, sulfato de cálcio, sílica gel, óxido de magnésio, alumina e carvão ativo. Ainda, a alumina usada comercialmente pode ser ácida, básica ou neutra. A alumina ácida é útil na separação de ácidos carboxílicos e aminoácidos; a básica é utilizada para a separação de aminas.

Materiais e Métodos:

Materiais Coluna cromatográfica, algodão, funil, béquer, pipeta, sílica-gel em pó, éter de petróleo, acetona, amostra (maceramento de folha em acetona resultando em uma mistura de cor verde).

Métodos Em uma coluna cromatográfica contendo um pequeno algodão na ponta mediu-se 5 cm de sílica-gel em pó e transferiu-se a sílica para um béquer. Por ser conhecida a polaridade dos solventes que serão utilizados, a sílica foi misturada em éter de petróleo, que é menos polar que a acetona e será o primeiro solvente a ser utilizado no procedimento de separação. Com a ajuda de um funil, a sílica foi colocada na coluna cromatográfica e o excesso de éter de petróleo foi retirado. Utilizando uma pipeta colocou-se a amostra dentro da coluna de forma a não criar rachaduras. Abriu-se novamente a ponta da coluna até que a amostra estivesse toda em contato com a sílica (sem haver líquido sobrando sobre o final da coluna).

Lentamente adicionou-se o éter de petróleo até a visualização de duas fases distintas. A fase amarela foi descendo enquanto a verde permanecia no topo da coluna. Após observar essa separação das fases encheu-se a coluna com éter de petróleo e colheu-se toda a fase amarela da amostra em um béquer, restando somente a fase verde no topo da coluna. Removeu-se também o restante de éter de petróleo que restou na coluna.

Ao início da eluição com acetona a coluna criou rachaduras em seu interior e para removêlas colocou-se algodão umedecido com clorofórmio por fora da coluna, cobrindo todos os pontos de rachadura. O clorofórmio esfria o ar presente na coluna facilitando sua retirada (diferença de pressão – a pressão da coluna sobre a rachadura é maior). Após a coluna voltar a ficar uniforme continuou-se a adição de acetona até a coleta de toda banda verde em outro béquer.

Resultados e Discussão:

O método de cromatografia de coluna permitiu a separação de duas bandas visíveis do extrato de folhas, a banda amarela que é uma mistura de carotenos e a banda verde que é uma mistura de clorofilas, devido à interação de cada banda com o solvente. A banda amarela interagiu com o éter de petróleo, pois ela é mais apolar do que a banda verde. A banda verde interagiu com a acetona, pois ela era mais polar.

Os aspectos que alteram a eficiência de uma coluna cromatográfica são o empacotamento da sílica-gel que compõe a coluna e a aplicação da mistura sobre a coluna. O empacotamento deve ser o mais uniforme possível, sem a presença de bolhas e rachaduras no interior da coluna, pois estas atrapalham a separação das bandas. A aplicação da mistura sobre a coluna deve ser pequena para que as bandas possam se separar completamente antes que a coluna termine.

Conclusão:

A separação de misturas contendo substâncias com diferentes polaridades através da cromatografia de coluna é eficiente, pois é possível separar completamente essas substâncias devido à sua interação com o solvente utilizado. Elas devem ser analisadas posteriormente para que haja certeza de que existe somente aquele determinado composto da mistura. Isso pode ser feito através da cromatografia de camada delgada.

Bibliografia:

ExperimentalDisponível em: <http://ube-164.pop.com.br/repositorio/48/meusite/qorganica

ECO-QUÍMICA, Portal de Química e Meio Ambiente – Química Fácil – Química Orgânica experimental/cromatografia.htm>. Acessado em 30/04/2009.

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