PCR EM TEMPO REAL - aula1

PCR EM TEMPO REAL - aula1

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PCR em Tempo Real Sistemas de Detecção

Dr Robson Francisco Carvalho rfcarvalho@ibb.unesp.br

Departamento de Morfologia

Sistemas de detecção -PCR em tempo real

Sistemas de detecção

PCR em tempo real: → Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente

Sistemas de detecção

PCR em tempo real: → Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente

Sistemas de detecção -PCR em tempo real

Sistemas de detecção

Principais métodos para detecção da fluorescência:

→Agentes ligantes de DNA (SYBR Green*) →Sondas de hidrólise (Taqman*, Lux*, Beacons*, Scorpions)

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Sistemas de detecção

SYBR Green: -Aumenta sua fluorescência quando ligado ao DNA dupla-fita

-Durante a fase de extensão →mais SYBR ligado ao produto da PCR

-Cada ciclo, mais sinal fluorescente édetectado

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Sistemas de detecção SYBR Green:

SYBR GreenDye

SYBR Greenfluoresce apenas quando estáligado ao DNA

Sistemas de detecção -PCR em tempo real

Sistemas de detecção

SYBR Green: -Desvantagem: ligação não-específica

-Vantagem: baixo cu$to

-Requer extensiva otimização

-Produtos longos →sinal muito forte -Requer curva de dissociação ou análise do gel

Sistemas de detecção -PCR em tempo real

Sistemas de detecção

SYBR Green: -Curva de dissociação

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Sistemas de detecção

SYBR Green: -Curva de dissociação

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Sistemas de detecção

SYBR Green: -Curva de dissociação

Dímero de primers

Sistemas de detecção -PCR em tempo real

Sistemas de detecção

Sonda de hidrólise:

Conjugada com:

- Fluorocromo “reporter” → emite fluorescência - Fluorocromo “quencher” → absorve fluorescência da sonda intacta

Sistemas de detecção -PCR em tempo real

Sistemas de detecção -PCR em tempo real

Sistemas de detecção Sonda de hidrólise:

LUX Fluorescência

Sistemas de detecção -PCR em tempo real

Sistemas de detecção Sonda de hidrólise:

Molecular Beacon Sistemas de detecção -PCR em tempo real

-Aumenta especificidade: sonda hibridizaespecificamente com o alvo →gera sinal fluorescente

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