Extração de DNA de plantas

Extração de DNA de plantas

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Extraçªo de DNA de plantas

Eduardo Romano, Biólogo Molecular, M.Sc.

Ana Cristina Miranda Brasileiro, Bióloga Molecular, Ph.D.

CENARGEN/Embrapa Recursos GenØticos e Biotecnologia. romano@cenargen.embrapa.br

isolamento de DNA de plantas e de material vegetal proveniente de cultura de tecidos Ø uma etapa importante na anÆlise da estrutura e organizaçªo do genoma de plantas. Essas anÆlises necessitam, freqüentemente,usar enzimas de restriçªo, que cortam o DNA em fragmentos, para ser que Ø utilizado em Southern blot ou em construçªo de bibliotecas genômicas. Preparaçıes de DNA vegetal tambØm sªo, comumente, utilizadas como substratos em reaçıes de PCR para estudos filogenØticos ou no desenvolvimento de marcadores moleculares como os microsatØlites e os gerados por RAPD. Independente do tipo de estudo molecular, as preparaçıes de DNA devem produzir amostras puras suficientes para nªo inibir os tratamentos enzimÆticos ou causar interferŒncias nos padrıes de migraçªo em gel de eletroforese.

Algumas consideraçıes sªo importantes na obtençªo de DNA de boa qualidade e devem ser atendidas independente do mØtodo utilizado. 1) As paredes celulares devem ser rompidas com o objetivo de liberar os constituintes celulares. Essa etapa Ø realizada geralmente pelo congelamento do tecido vegetal em nitrogŒnio líquido e posterior quebra mecânica, com o auxílio de um pilªo e de um almofariz, no caso de extraçªo em larga escala. Para extraçªo em pequena escala, utiliza-se um pequeno bastªo de vidro e um tubo de microcentrífuga. Nesse caso, as preparaçıes freqüentemente se destinam a reaçıes de PCR e podem ser realizadas somente na presença de tampªo de extraçªo, sem a adiçªo de nitrogŒnio líquido. 2) As membranas celulares devem ser rompidas para liberaçªo do DNA. Essa etapa Ø realizada pela açªo de um detergente como SDS (dodecil sulfato de sódio) ou CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio). 3) Deve-se evitar a açªo de DNA- ses, que podem degradar o DNA. Com esse propósito, os tampıes de extraçªo possuem pH por volta de 8,0, enquanto o pH ótimo para açªo de DNAses endógenas fica por volta de 7,0. Outro expediente empregado Ø a adiçªo de EDTA (Æcido etileno diamono tetracØtico) no tampªo de extraçªo. O EDTA Ø uma substância quelante de cÆtions divalentes, como Mg+2 e Ca+2 e, portanto, inibe a açªo de DNAses, que usam esses metais como cofatores (Sambrook et al., 1989). 4) `cidos nuclØicos devem ser separados das proteínas. Para tanto, realiza-se de uma a vÆrias extraçıes com fenol e/ou clorofórmio, que desnaturam as proteínas tornando-as insolœveis à fase aquosa, onde se encontram os Æcidos nuclØicos. 5) O DNA deve ser protegido da açªo de compostos fenólicos, que oxidam o DNA irreversivelmente, tornando este inacessível às enzimas de restriçªo. A contaminaçªo por compostos fenólicos pode ser evidenciada pela coloraçªo do DNA que tende a ficar marrom. Para evitar o efeito oxidativo dos polifenóis, deve ser adicionado ao tampªo de extraçªo agentes anti-oxidantes, como PVP (polivinilpirrolidona), BSA (albumina de soro bovino) ou β-mercaptoetanol.

Figura 1: Esquema representativo das etapas de extraçªo de DNA pelo mØtodo CTAB.

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6) Os Æcidos nuclØicos devem ser separados de polissacarídeos. Esses inibem a açªo de enzimas de restriçªo (Shioda & Marakami-Muofushi, 1987) e tornam a amostra de DNA excessivamente viscosa, interferindo na migraçªo do DNA em corridas eletroforØticas. O detergente CTAB Ø utilizado com essa finalidade, jÆ que polissacarídeos e Æcidos nuclØicos possuem solubilidade diferenciada na presença desse detergente. Polissacarídeos tambØm podem ser removidos pelo emprego de gradiente de cloreto de cØsio (CsCl).

VÆrios autores descrevem problemas no isolamento e purificaçªo de DNA vegetal de boa qualidade (para uma revisªo ver: Rogers & Bendich, 1994). Esses problemas sªo resultantes principalmente do co-isolamento de polissacarídeos, substâncias fenólicas e compostos secundÆrios.

O mØtodo mais utilizado com sucesso para diferentes espØcies Ø o baseado no uso do detergente CTAB. Esse detergente solubiliza as membranas, formando com o DNA um complexo que facilita uma posterior precipitaçªo (Weising et al., 1995). A maioria dos protocolos descritos na literatura utilizam o protocolo CTAB padrªo, com algumas modificaçıes, com vistas a resolver problemas específicos da espØcie em estudo. Outros protocolos freqüentemente empregados sªo variaçıes do descrito por Dellaporta e colaboradores (Dellaporta et al, 1983). Esses mØtodos se fundamentam na precipitaçªo simultânea de proteínas e polissacarídeos na presença de SDS e altas concentraçıes de acetato de potÆssio. Outro mØtodo utilizado Ø a extraçªo de DNA por meio de nœcleos celulares. Essa estratØgia Ø baseada em uma prØvia separaçªo dos nœcleos dos outros constituintes celulares. Esse procedimento pode resolver o problema de co-isolamento de constituintes indesejÆveis, como os polissacarídeos e polifenóis citoplasmÆticos. A principal desvantagem deste mØtodo Ø que a extraçªo de nœcleos a partir de material congelado Ø muito ineficiente. Outra desvantagem Ø que esse mØtodo Ø mais laborioso do que os previamente mencionados. As preparaçıes de DNA obtidas por qualquer um desses mØtodos podem sofrer uma posterior purificaçªo por centrifugaçªo em gradiente de densidade de CsCl. Essa purificaçªo, apesar de laboriosa, Ø eficiente na remoçªo de RNA, polissacarídeos, proteínas e outros contaminantes da amostra de DNA. Outra estratØgia para purificaçªo do DNA isolado Ø a precipitaçªo com acetato de amônio. Essa estratØgia Ø mais rÆpida, porØm o DNA purificado Ø de menor qualidade.

Nesse artigo descrevemos um protocolo CTAB padrªo utilizado com sucesso em nosso laboratório, em diferentes espØcies, e dois protocolos de purificaçªo (gradiente de CsCl e acetato de amônio). Apresentamos tambØm uma tabela (tabela 1), onde sªo identificados os problemas comumente encontrados na extraçªo de DNA por meio do protocolo CTAB. Dessa forma, o leitor poderÆ identificar o problema e tentar fazer as modificaçıes necessÆrias para melhorar a qualidade do DNA. Na tabela 2, estªo listadas algumas espØcies vegetais para as quais foram necessÆrias adaptaçıes de protocolos bÆ- sicos, visando à resoluçªo de problemas específicos.

Tabela 1: Problemas comumente encontrados durante o isolamento de DNA de plantas; possíveis causas e soluçıes.

Problema encontrado Amostra de DNA marrom ou muito escura.

Amostra de DNA com aspecto gelatinoso e excessivamente viscoso.

O DNA, antes da digestªo com enzimas de restriçªo, apresenta arraste vertical no gel.

O DNA apresenta forma cônica no gel, em direçªo ao pólo positivo.

Após a corrida, muito DNA retido no poço do gel.

Após digestªo com enzima de restriçªo, a amostra apresenta uma corrida com muito DNA nas laterais e pouco DNA no centro.

O DNA no gel apresenta contaminaçªo com RNA.

Causa Contaminaçªo por polifenóis.

Contaminaçªo por polissacarídeos.

DNA degradado por contaminaçªo por DNAses ou por quebra mecânica durante a extraçªo com clorofórmio.

Excesso de DNA aplicado no gel. Contaminaçªo por polissacarídeos.

Contaminaçªo por polissacarídeos.

Contaminaçªo por polissacarídeos. Excesso de DNA aplicado no gel.

Contaminaçªo por RNA.

Soluçªo Adiçªo de PVP-40 e/ou BSA no tampªo de extraçªo, a concentraçªo de 1 a 2%. Aumento da concentraçªo de ßmercaptoetanol para atØ 5%.

Purificaçªo da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitaçªo com acetato de amônio. Extrato de DNA via nœcleos celulares.

Verificar o pH do tampªo de extraçªo. Este deve estar por volta de 8,0. Se o pH estiver por volta de 7,0 facilitarÆ a açªo de DNAses durante a extraçªo Mistura das fases aquosa e de clorofórmio menos vigorosamente.

Aplicar menos DNA no gel. Purificaçªo da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitaçªo com acetato de amônio; Extraçªo de DNA via nœcleos celulares.

Purificaçªo da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitaçªo com acetato de amônio; Extraçªo de DNA via nœcleos celulares.

Purificaçªo da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitaçªo com acetato de amônio; Extraçªo de DNA via nœcleos celulares; Aplicaçªo de menos DNA no gel.

Adicionar RNAse A, a uma concentraçªo final de 100µg/mL e incubar a 37”C por 20 minutos.

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Protocolos

Isolamento de DNA total de plantas utilizando-se o mØtodo CTAB (Figura 1)

1.Pese 3 g do material vegetal a ser analisado (calos, folhas, plântulas etc.), de preferŒncia fresco, e transfira para um almofariz contendo com nitrogŒnio líquido. Com o auxílio de um pilªo, pulverize o material atØ se obter um pó fino. 2. Transfira rapidamente o pó obtido para um tubo de polipropileno de 50 ml que contenha 15 ml de tampªo CTAB [CTAB 2% (p/v); NaCl 1,4 M; Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM; β-mercaptoetanol 0,2% (v/v)] prØ-aquecido a 65oC. Feche o tubo e misture gentilmente atØ o pó ficar homogeneamente distribuído. 3. Incube as amostras em banhomaria a 60oC por 30 minutos, agitando ocasionalmente o tubo para manter o extrato ressuspendido. 4. Retire o tubo do banho-maria e espere que a mistura atinja a temperatura ambiente. Adicione 15 ml de clorofórmio:Ælcool isoamílico (24:1; v/v). Feche o tubo e misture manualmente por 10 minutos. 5. Centrifugue a 5.0 g por 10 minutos a temperatura ambiente, para separar a fase orgânica da aquosa. 6. Remova a fase aquosa (fase superior) para um tubo novo de 50

Tabela 2 - Principais espØcies vegetais para as quais foram necessÆrias adaptaçıes de protocolos bÆsicos, visando à resoluçªo de problemas específicos (adaptado de Weising et al. 1995).

EspØcie vegetal

Abies alba (abeto) Betula alba (bØtula) Glycine max (soja)

Gossypium hirsutum (algodªo) Fragaria x ananassa (morango)

Helianthus annus (girassol) Hordeum vulgare (cevada)

Ipomoea batatas (batata-doce) Linum usitatissimum (linho)

Lycopersicon esculentum (tomate)

Musa acuminata (bananeira)

Nelumbo spp. (lótus)

Nicotiana tabacum (fumo)

Oryza sativa (arroz) Picea abies (aberto)

Pisium sativum (ervilha)

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