Meios de cultura - Apostilas - Biotecnologia Parte1, Notas de estudo de Biotecnologia

Baixe Meios de cultura - Apostilas - Biotecnologia Parte1 e outras Notas de estudo em PDF para Biotecnologia, somente na Docsity! Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos Módulo IV ÍNDICE 1. Introdução ........................................................................................................................1 Procedimentos gerais ...........................................................................................................1 2. Meios de cultura para transporte e conservação ...............................................................2 Cary Blair...........................................................................................................................2 Salina Tamponada ...............................................................................................................2 Meio Stuart ........................................................................................................................3 Ágar nutriente ....................................................................................................................4 3. Meios para crescimento e isolamento................................................................................6 Ágar Chocolate....................................................................................................................6 Ágar Thayer-Martin Chocolate ...............................................................................................7 Ágar Salmonella-Shigella (ss)................................................................................................7 Caldo Selenito.....................................................................................................................8 Caldo Tetrationato ...............................................................................................................9 Caldo Tioglicolato com indicador .......................................................................................... 10 Caldo Tioglicolato sem indicador .......................................................................................... 11 Ágar Mac Conkey .............................................................................................................. 12 Ágar Sangue..................................................................................................................... 13 Ágar CLED – cystine lactose electrolyte deficient .................................................................... 14 Caldo BHI – brain heart infusion .......................................................................................... 15 Löwenstein Jensen............................................................................................................. 16 Meio bifásico: Löwenstein e Middlebrook ............................................................................... 18 Ágar Mycosel .................................................................................................................... 19 Ágar Sabouraud ................................................................................................................ 20 4. Meios comerciais para provas de identificação ................................................................22 Base de nitrogênio para leveduras – Yeast Nitrogen Base ........................................................ 22 Ágar Citrato Simmons ........................................................................................................ 23 Ágar Bílis-Esculina ............................................................................................................. 24 Ágar Sangue - CAMP.......................................................................................................... 25 Caldo base de Moeller ........................................................................................................ 26 Ágar Dnase ...................................................................................................................... 28 Ágar Esculina.................................................................................................................... 30 Ágar Fenilalanina............................................................................................................... 31 CTA – Cystine Tryticase Agar .............................................................................................. 32 Caldo Triptona e SIM ......................................................................................................... 33 Meio Caldo Triptona ........................................................................................................... 34 Caldo Malonato ................................................................................................................. 35 Caldo Nitrato .................................................................................................................... 36 Meio base para oxidação e fermentação - OF......................................................................... 38 Ágar TSI – triplo açúcar ferro .............................................................................................. 40 Ágar base uréia (christensen).............................................................................................. 41 5. Fórmulas e produtos para provas de identificação ..........................................................43 Para prova de catalase ....................................................................................................... 43 Para prova de coagulase..................................................................................................... 43 Para prova de gelatinase .................................................................................................... 45 Para prova de lecitinase ..................................................................................................... 46 Para prova de oxidase........................................................................................................ 47 Para fermentação de carboidratos........................................................................................ 48 Para a prova de hidrólise .................................................................................................... 49 Para crescimento a 42 e 44°c.............................................................................................. 50 Para teste de motilidade..................................................................................................... 51 Para prova de tolerância ao NaCl 6,5%................................................................................. 55 6. Discos para identificação.................................................................................................57 Bacitracina ....................................................................................................................... 57 Novobiocina...................................................................................................................... 57 Optoquina ........................................................................................................................ 58 7. Meios para teste de sensibilidade aos antimicrobianos ...................................................60 HTM – haemophilus test médium ......................................................................................... 60 Ágar Mueller Hinton ........................................................................................................... 61 Ágar Mueller Hinton Sangue................................................................................................ 62 8. Referências bibliográficas ...............................................................................................64 Mod IV - 3 PRINCÍPIO Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável. UTILIDADE Meio de transporte de fezes. FÓRMULA /PRODUTO Fórmula: NaCl 4,2 g ـ Fosfato dipotássico anidro 3,1 g ـ Glicerina bidestilada 300 ml ـ Água destilada 700 ml ـ PROCEDIMENTOS Distribuir 10 ml em cada tubo de 16 x 160 mm; Esterilizar em autoclave. CONTROLE DE QUALIDADE Shigella flexneri ATCC 12022 INOCULAÇÃO Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar; Incubar a 35 ±1°C por 12 a 18 horas. INTERPRETAÇÃO O crescimento é indicado pela turbidez do meio. Após incubação semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de SS e/ou MacConkey. CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 8°C por até 3 meses. MEIO STUART PRINCÍPIO A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microorganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles. UTILIDADE Transporte de diversos materiais e conseqüente conservação dos microorganismos. Conservação de microorganismos patogênicos como: Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros. FÓRMULA / PRODUTO Meios comercial: Meio de transporte STUART PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Fundir completamente; Distribuir 7 ml por tubo; Mod IV - 4 Esterilizar em autoclave; Após retirar da autoclave, manter os tubos em posição vertical para que solidifiquem. pH: 7,4 +/- 0,2 CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento): Haemophilus influenzae ATCC 10211 Shigella flexneri ATCC 12022 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Bordetella pertussis ATCC 9340 CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por 1 a 2 semanas. INOCULAÇÃO O material biológico deve ser coletado com auxílio de um "swab" estéril com haste de madeira; Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contém o algodão fique no meio de cultura; Fechar o tubo; Manter em temperatura ambiente até o momento de semear nos meios seletivos adequados. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: Branco opalescente. Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano. RECOMENDAÇÕES Não deixar o meio com a tampa aberta ou semi aberta após a semeadura. ÁGAR NUTRIENTE PRINCÍPIO O Nutriente Ágar é um meio relativamente simples, de fácil preparação e barato, muito usado nos procedimentos do laboratório de Microbiologia. UTILIDADE nutriente ágar tem várias aplicações no laboratório de Microbiologia, e pode ser utilizado para análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras. uso mais freqüente é para a conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente neste ágar, como método opcional para os laboratórios que não dispõem do método da crioconservação (congelamento das cepas em freezer à - 70ºC). Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos. FÓRMULA / PRODUTO Produto: Nutriente Ágar Fórmula: Extrato de carne 3 g ـ Peptona 5 g ـ Ágar ágar 15 g ـ Água destilada 1000 ml ـ pH: 6,8 +/- 0,2 ـ Mod IV - 5 PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar os componentes; Fundir; Distribuir 3 ml por tubo; Esterilizar em autoclave; Após retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfície em forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º). CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento bom a excelente: Escherichia coli ATCC 25922 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses. INOCULAÇÃO Estriar a superfície inclinada do meio; Incubar. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: branco opalescente Positivo: Crescimento na superfície do ágar; Negativo: Ausência de crescimento. RECOMENDAÇÕES Usar tubos com tampa de rosca para evitar ressecamento do ágar. Repicar as cepas conservadas a cada 3 meses. Conservar as cepas após o crescimento no meio em temperatura ambiente. Por ser um meio nutritivo, a ausência de crescimento não deverá ocorrer. Mod IV - 8 UTILIDADE Selecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e água. FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Ágar SS. PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer o meio até fundir o ágar; Não autoclavar; Resfriar até 50°C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estéreis; Deixar em temperatura ambiente até resfriar; Embalar as placas com plástico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8°C. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Salmonella typhimurium ATCC 14028. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. INOCULAÇÃO Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: vermelho alaranjado. Colônias com centro negro (H²S) ou colônias incolores: suspeita de Salmonella. Colônias incolores: suspeita de Shigella spp. Colônias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp. As bactérias não fermentadoras de lactose são incolores. As bactérias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa. CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por 3 meses. RECOMENDAÇÕES Ausência de crescimento ou crescimento escasso, reincubar a placa mais 24 horas. Não autoclavar, pois a alta temperatura degrada o açúcar contido no meio. CALDO SELENITO PRINCÍPIO Tem propriedades que inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos. UTILIDADE Utilizado para o enriquecimento e isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos. FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Selenito Novobiocina PROCEDIMENTOS Mod IV - 9 Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer até levantar fervura, homogeneizando de vez em quando; Não autoclavar; Aguardar esfriar e adicionar 0,04 g de novobiocina por litro de meio (novobiocina inibe o véu de Proteus spp.); Distribuir 7 ml em tubos estéreis de 15x150 mm com tampa de rosca. CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento: Preparar uma suspensão de Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella typhimurium ATCC 14028 na escala 0,5 de Mac Farland; Semear 0,01 ml da suspensão na placa de SS; Incubar a placa a 35 ±1°C por 12 a 18 horas. .Positivo: crescimento da Salmonella typhimurium ـ .Negativo: não á crescimento de Escherichia coli ـ INOCULAÇÃO Inocular 3 a 4 alçadas da amostra de fezes no meio de cultura; Incubar a 35±1°C por 12 a 18 horas. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: vermelho tijolo. Após incubação, semear com o auxílio de uma alça bacteriológica em meios seletivos e enriquecidos (SS, Mac Conkey, XLD, Hectoen). CALDO TETRATIONATO PRINCÍPIO Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem microrganismos Gram positivos e a adição da solução de iodo inibe a flora intestinal normal de espécies fecais. UTILIDADE Meio de enriquecimento para Salmonella spp. FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Caldo Tetrationato. Solução de Iodo para tetrationato: para ser adicionado no caldo antes de semeada a amostra de fezes. Iodo metálico 6,0 g ـ Iodeto de potássio 5,0 g ـ Água destilada 20,0 ml ـ PROCEDIMENTOS Caldo tetrationato Pesar e hidratar o meio segundo instruções do fabricante; Aquecer até ferver; Distribuir 10 ml em tubos estéreis com tampa de rosca; Não autoclavar. Solução de iodeto de potássio Macerar o iodeto de potássio e o iodo em um graal; Adicionar água aos poucos até dissolver completamente; Colocar em frasco âmbar. Mod IV - 10 CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento: Preparar uma suspensão de Salmonella typhimurium ATCC 14028 e uma cepa de Escherichia coli ATCC 25922 na escala 0,5 de Mac Farland; Semear 0,01 ml da suspensão em uma placa de SS; Se houver crescimento de Salmonella e inibição de Escherichia coli, liberar o lote para uso. INOCULAÇÃO Adicionar 0,2 ml da solução de iodo no tubo; Inocular 1a 3 g da amostra de fezes e homogeneizar vigorosamente; Incubar a 35 ±1°C por 12 a 18 horas. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: límpido com precipitado branco. O crescimento é indicado pela turbidez do meio. Após incubação, semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de SS e/ou Mac Conkey. CONSERVAÇÃO E VALIDADE Tetrationato: Conservar de 4 a 8°C por até 4 meses. Solução de iodo: Conservar em frasco âmbar a temperatura ambiente por até 12 meses. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Neisseria gonorrhoeae 43069 e Neisseria meningitidis 13090. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses. INOCULAÇAO Usar a técnica de semeadura por esgotamento; Incubar em CO2 e umidade (jarra com vela acesa e um chumaço de algodão embebido em água); Incubação por 48 horas. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). Colônias pequenas com pigmento creme: sugestivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis. Fazer esfregaço de todas as colônias suspeitas e corar pela técnica de Gram, para confirmar se trata-se ou não de Neisseria (diplococos Gram negativos reniformes). Confirmando a morfologia pelo Gram, seguir identificação com testes de oxidase e provas de fermentação. RECOMENDAÇÕES Antes de semear o material biológico aquecer o meio de cultura em estufa à 35ºC, pois temperaturas baixas podem inibir o crescimento de Neisserias; Não usar meio, suplementos e sangue vencidos; Se não for incubado em CO2 e não houver crescimento, pode ser um resultado falso - negativo, pois as Neisserias necessitam de atmosfera com o CO2 para o crescimento; Se não houver crescimento, incubar até 5 dias. CALDO TIOGLICOLATO COM INDICADOR Mod IV - 13 FÓRMULA /PRODUTO Meio comercial: Ágar MacConkey. PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer sob agitação até fundir o ágar completamente; Esterilizar em autoclave; Resfriar até 50°C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estéreis; Deixar em temperatura ambiente até resfriar; Embalar as placas com plástico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8°C. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Proteus mirabilis ATCC 12453 (não fermentador de lactose). Positivo: Escherichia coli ATCC 25922 (fermentador de lactose). Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. INOCULAÇÃO Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: rosa avermelhado. Crescimento de bacilos Gram negativos. Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose. Colônias incolores: não fermentadoras de lactose. Não há crescimento de cocos Gram positivos. CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar as placas embaladas de 4 a 8°C por até 3 meses. ÁGAR SANGUE PRINCÍPIO O meio de Ágar sangue, usando uma base rica como abaixo descrita, oferece ótimas condições de crescimento a maioria dos microrganismos. A conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. UTILIDADE Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos. Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. Usado na prova de satelitismo (para identificação presuntiva de Haemophilus spp.). FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Blood Ágar Base, Columbia Ágar Base, BHI Ágar, Mueller Hinton Ágar; Sangue desfibrinado de carneiro ou coelho: .ml para cada 100 ml de meio base 5 ـ pH: 6,8 +/- 0,2 ـ PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Mod IV - 14 Esterilizar em autoclave; Esfriar a base à +/- 50ºC; Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de base; Homogeneizar delicadamente para não formar bolhas; Distribuir em placas de Petri de 90 mm de diâmetro. CONTROLE DE QUALIDADE Hemólise beta hemolítica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC 25923. Hemólise alfa hemolítica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305. Hemólise gama (sem hemólise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228. CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 10°C por 4 meses. INOCULAÇÃO Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura para isolamento; No final da semeadura, picar o meio com a alça para verificar hemólise em profundidade; Incubar à 35ºC 24 horas. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: vermelho. Beta hemólise: presença de halo transparente ao redor das colônias semeadas (lise total dos eritrócitos). Alfa hemólise: presença de halo esverdeado ao redor das colônias semeadas (lise parcial dos eritrócitos). Gama hemólise (sem hemólise): ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem íntegros). RECOMENDAÇÕES Não usar sangue de carneiro vencido, pois o meio fica hemolisado ou com cor muito escura, dificultando o estudo de hemólise; Não usar sangue humano, pois alguns microrganismos não apresentam hemólise; Não adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemácias rompem-se, dificultando o estude de hemólise; Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biológicos em geral costuma ser abundante, sempre que necessário, isolar a colônia em estudo para os procedimentos de identificação, para não correr o risco de trabalhar com cepas misturadas. ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT PRINCÍPIO Usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras urina. A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus. UTILIDADE Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras. FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Ágar Cled. Mod IV - 15 PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar à +/- 50°C e distribuir de 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estéreis; Deixar em temperatura ambiente até resfriar. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a denso, colônias ـ médias ou grandes amareladas, após 48 horas de incubação. Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a denso, colônias azuis ـ translúcidas. Negativo: ausência de crescimento INOCULAÇÃO Verificar técnica de semeadura quantitativa. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: azul claro. Colônias lactose positiva: cor amarela. Colônias lactose negativa: cor azul. Características de crescimento: Escherichia coli: colônias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de diâmetro, as não fermentadoras de lactose colônias azuis Espécies de Klebsiella: colônias muito mucosas, cor variável de amarelo a branco azulado Espécies de Proteus: colônias azul translúcidas, geralmente menor que E.coli Espécies de Salmonella: colônias planas, cor azul Enterococcus faecalis: colônias amarelas, com cerca de 0,5 mm de diâmetro Staphylococcus aureus: colônias amarelas, com cerca de 0,75 mm de diâmetro Staphylococcus coagulase negativa: colônias amarelo palha e brancas Corynebacterium: colônias pequenas e cinza Lactobacilos: colônias pequenas e com superfície rugosa Pseudomonas aeruginosa: colônias verdes, com superfície prateada e periferia rugosa CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses. RECOMENDAÇÕES Organismos que fermentam lactose baixam o pH e mudam a cor do meio de verde para amarelo, podendo assim verificar se o microrganismo é lactose negativa ou positiva; Espécies de Shigella não crescem em meios deficientes em eletrólitos. CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION PRINCÍPIO É um meio derivado de nutrientes de cérebro e coração, peptona e dextrose. A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas. Mod IV - 18 CONTROLE DE QUALIDADE Esterilização: colocar todos os tubos em estufa; Crescimento bom a excelente: Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618 Mycobacterium avium ATCC 25291 CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar entre 4 a 8ºC por 3 meses. INOCULAÇÃO Para materiais biológicos de sítios contaminados, fazer descontaminação prévia pelas técnicas desejadas (Petroff, NALC, Lauril sulfato de sódio, Corper & Stoner modificado); Semear 5 gotas ou mais, cobrindo bem a superfície do meio; Manter os tubos inclinados com a tampa semi aberta até secar bem o inóculo; Depois de seco o inóculo, rosquear os tubos e incubar 60 dias à 35ºC; Semanalmente, abrir as tampas próximo ao bico de Bunsen para ventilar os cultivos e observar a presença ou não de crescimento. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: verde claro Positivo: Crescimento de colônias amarelas Negativo: ausência de crescimento. RECOMENDAÇÕES Como é um meio rico em proteínas, bactérias proteolíticas contaminam o meio, liqüefazendo-o, para isto, deve-se fazer uma leitura com 24 horas de incubação para tirar as culturas que possam ter contaminado; Não usar ovos velhos; Não quebrar mais que um ovo por vez, pois pode ter algum estragado e contaminar os demais; Manter sempre mais que um béquer estéril para o caso de haver algum ovo estragado; Não liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubação, pois as micobactérias desenvolvem-se lentamente; Fazer um esfregaço do crescimento e corar pela técnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo Álcool Ácido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo. MEIO BIFÁSICO: LÖWENSTEIN E MIDDLEBROOK PRINCÍPIO O meio é constituído de duas fases, uma sólida que é o meio de Löwenstein Jensen e uma líquida, que é o meio 7H-9, juntos fornecem os nutrientes necessários para o desenvolvimento das micobactérias isoladas de materiais nobres. UTILIDADE Sistema desenvolvido para o isolamento de micobactérias do sangue e de materiais paucibacilares, como líquor, líquido pleural, biópsias, entre outros. FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Löwenstein Jensen ou Löwenstein Medium Base Meio comercial: Middlebrook 7H-9 broth Meio comercial: Middlebrook Enrichment (suplemento para enriquecimento). Ovos de galinha frescos Mod IV - 19 PROCEDIMENTOS Meio de Löwenstein Jensen: procedimento igual ao já descrito, distribuindo 12 ml do meio em frascos estéreis com capacidade para 100 ml (usar tampão de algodão e depois do meio pronto - parte sólida e líquida, substituir por tampa de borracha e lacre de alumínio) e coagulando os frascos bem inclinados. Meio Middlebrook 7H-9 broth: ;Pesar e hidratar conforme instruções do fabricante ـ ;Adicionar o glicerol, conforme instruções do fabricante ـ ;Esterilizar em autoclave ـ ;Resfriar a base à - 50ºC ـ ;Adicionar o suplemento Middlebrook Enrichment, conforme instruções do fabricante ـ ;Homogeneizar bem ـ ;Distribuir 15 ml em cada frasco de Löwenstein Jensen inclinado ـ ;Fazer o controle de qualidade de esterilidade ـ Lacrar os frascos com tampa de borracha (previamente submersas em álcool etílico 70% ـ durante 30 minutos) e lacre de alumínio. pH: 6,6 +/- 0,2 ـ CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento bom a excelente: Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 e Mycobacterium fortuitum ATCC 6841. CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar os frascos embalados de 4 a 8°C por até 3 meses. INOCULAÇÃO Por serem materiais estéreis, não é necessário a descontaminação; Colher assepticamente 5 ml de sangue e inocular no frasco ; Se for outro material, inocular até 5 ml de material; Incubar durante 60 dias à 35º /- 0,2; Banhar o meio sólido semanalmente. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: parte sólida: verde clara, parte líquida: âmbar claro. Positivo: turvação do meio líquido e crescimento de colônias amarelas no meio sólido. Negativo: ausência de turvação e crescimento nos meios líquido e sólido. RECOMENDAÇÕES Não usar frascos com meio líquido turvo; Volumes de inóculos inferires a 2,5 ml podem resultar em culturas falso - negativas; Não liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubação, pois as micobactérias desenvolvem-se lentamente; Fazer um esfregaço do crescimento e corar pela técnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo Álcool Ácido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo. ÁGAR MYCOSEL PRINCÍPIO Mod IV - 20 A Cicloheximida, um dos componentes do meio, serve para selecionar dermatófitos o cloranfenicol inibe o crescimento de bactérias e alguns fungos filamentosos. UTILIDADE Isolamento de fungos patogênicos, principalmente dermatófitos, a partir de material de investigação contaminado. FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Mycosel Ágar, Mycobiotic Ágar ou Ágar seletivo para fungos patogênicos. PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar à +/- 50ºC e distribuir em placas de 90 mm de diâmetro ou 4 ml por tubo; Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinação em forma de bico de flauta (ângulo de 45º). pH: 6,9 +/- 0,1 CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento bom a excelente: Trichophyton verrucosum ATCC 36058, Candida albicans ATCC 10231. Crescimento inibido: Aspergillus niger ATCC 16404, Candida tropicalis, Penicillium spp. CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses. INOCULAÇÃO Inocular sempre dois tubos ou placas; Se em placa: semear com a técnica de semeadura quantitativa; Se em tubo: estriar na superfície inclinada do meio; Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro a 37ºC; Observar diariamente a presença ou não de crescimento; Incubar 40 dias. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: amarelo claro opalescente. Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do microrganismo que cresceu. RECOMENDAÇÕES A ausência de crescimento não indica uma cultura negativa para fungos, pois alguns fungos podem ter o crescimento inibido neste meio. Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubação demorada resseca com facilidade o meio contido em placas. ÁGAR SABOURAUD PRINCÍPIO Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leve duriformes e filamentosos. UTILIDADE