Técnicas imunoquímicas

Técnicas imunoquímicas

Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnóstico lEspecificidadeEspecificidade Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.

lQuantidadeQuantidade

N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção.

lIsotipoIsotipo Determina a persistência (meia vida in vivo diferente).

A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados.

lAfinidadeAfinidade

Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário.

lAvidez:Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.

Avidez x Afinidade Avidez x Afinidade

INTERAÇÕES lReações reversíveisReações reversíveis.

lLigações não covalentes:Ligações não covalentes: Pontes de hidrogênio

Interações hidrofóbicas

Interações de Van der Waals Ligações iônicas

1)Reagentes não marcados •Reação de precipitação

•Reação de aglutinação

2)Reagentes marcados

• Imunofluorescência

•Western Blotting lPRECIPITAÇÃOPRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla

- Imunodifusão radial

- Imunoeletroforese lAGLUTINAÇÃOAGLUTINAÇÃO

- Aglutinação direta e indireta - Inibição da aglutinação

- Teste de Coombs lIMUNOENSAIOSIMUNOENSAIOS

- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo

-Western Blotting

- - Pesquisa - Diagnóstico

- Soroepidemiologia lPrecipitação:Precipitação: Formação de complexos Ag/Ac.

lAglutinação:Aglutinação:

É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.

lAs reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.

lInteração entre Ac e Ag solúvel lAc precisa ser bivalente lAg precisa ser bi ou polivalente lA reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA

É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo:

Zona de excesso de anticorpo

Zona de equivalência

Zona de excesso de antígeno

Anticorpo livre

Antígeno livre

100%-- Percentual de complexo imune precipitado

Quantidade de antígeno adicionado

•Coloca-se agarose sobre uma lâmina: Imunodifusão Dupla:

•Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac Ag Ag

Ag Ag Ac

Ag Ag

Utilização: muito usada em pesquisa e diagnóstico de algumas doenças, como cisticercose lAs soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação:

lPode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante lPermite a quantificação do antígeno ou do anticorpo.

lO processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitandose em um anel (halo) em torno do orifício.

Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados Agarose contendo anticorpos anti-IgG humana

Halo de precipitação IgG – anti-

IgG

Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas.

lPode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.

lAs moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.

lUma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.

lAg e Ac formam arcos de precipitação.

1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna canaleta

2- Anti-soro na canaleta canaleta

3- Difusão e precipitação lAc + Ag multivalente particulado lTítulo:maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-quantitativo) lPó-zona: excesso de Ac lPotencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica (repulsão) lAgregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

1) Amostra de sangue na placa teste: Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

3) Controle negativo:

4) Mistura-se: AGLUTINAÇÃO DIRETA

5) Leitura do resultado:

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.

negativopositivo

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas:

•As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa.

•O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.

•Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutiname formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço.

Aglutinação Positiva

Negativa

Ag solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias)

Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez) INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO

+ Soro anti - hCGUrina

São incubados e colocados numa placa

Adicionam-se Partículas revestidas com hCG

Resultado positivo:

(presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.

Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial

Resultado negativo: (ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.

Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs);

DHRN – mãe produz IgG anti-Rh; Não aglutinam os eritrócitos;

Direto: Ac ligados aos eritrócitos fetais;

Indireto: Ac anti-Rh não aglutinantes no soro materno.

Permite detectar incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.

lReagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos) lTipos:

Princípio da técnica:

lAnticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível.

lAssim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.

lA reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência).

lPrincipais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –

FITC) e rodamina(isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.

Microscópio de fluorescência com epiluminação

luz UV atinge o ma- terial examinado fluorescência emitida chega ao observador

IFA direta:

lDetecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.

lDiagnóstico sorológico devárias doenças infecciosas como a Doença

IFA indireta: de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças autoimunes.

lÉ uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais intensa) e especificidade.

Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em uma corrente através de um feixe de Laser.

Separa as células por fluorescência ativada. Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. É um teste qualitativo e quantitativo.

Tipo de linfócitos; Quantidade, tamanho, granulosidade; Isolamento de populações celulares; HIV

Ensaio Imunoadsorvente

Ligado à Enzima - ELISA

O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.

O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora).

A quantidade de Ag ou Acproduto final corado, através

de leitura em fotocolorímetro.

Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.

Fosfatase alcalina

Peroxidase B-galactosidase

TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto

ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

ØAplicações do ELISA: §Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa

ØVantagens: §Teste de alta sensibilidade

§Permite quantificar Ag ou Ac das amostras

§Seguros e de baixo custo

ELISA Competitivo

Ø Marcações: lI125: emite raios gama lH3: raios beta

ØReprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g) ØDesvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Ø Aplicações:

Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa

lEletroforese de proteínas.

lIdentifica antígenos ou anticorpos.

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