A Reação em Cadeia da Polimerase

A Reação em Cadeia da Polimerase

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Farmácia UFRN 2010

A Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica de Biologia Molecular que permite replicação in vitro do ADN de forma extremamente rápida. Com a PCR, quantidades mínimas de material genético podem ser amplificadas milhões de vezes em poucas horas, permitindo a detecção rápida e fiável dos marcadores genéticos de doenças infecciosas, cancro ou doenças genéticas. O uso da tecnologia de Reacção em Cadeia da Polimerase aumentou enormemente a capacidade dos cientistas para estudar o material genético. Desde a sua invenção por cientistas da Cetus Corporation em 1983, a PCR mudou a forma como se realiza investigação e diagnóstico médico. A capacidade de produzir rapidamente grandes quantidades de material genético permitiu avanços científicos significativos em todas as áreas de investigação genómica. A tecnologia de PCR influenciou ainda significativamente as áreas de diagnóstico e seguimento de doentes, em particular nas áreas de HIV/SIDA e Hepatite C. Desde o primeiro momento, os cientistas da Roche aperceberam-se da importância e do potencial da tecnologia de PCR. A Roche tem vindo a desenvolver esforços no sentido de aperfeiçoar os vários passos e componentes da reacção de replicação (por exemplo, enzimas polimerases termoestáveis). A Roche oferece preparações enzimáticas optimizadas e inovadoras, kits de qualidade e fiabilidade, que permitem a obtenção de óptimos resultados.

 

A PCR está desenhada de acordo com o princípio natural de replicação de ADN. Este é um processo que decorre em três passos, que em conjunto se designam como um ciclo e que se repete um número específico de vezes. Assim, um ciclo de PCR consiste nos seguintes passos:      1. Desnaturação      2. Hibridização ou Annealing      3. Extensão Este processo tem lugar num termociclador, um equipamento que automaticamente controla e alterna as temperaturas durante períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR (geralmente entre 30 e 40 ciclos).

 

A temperatura elevada (geralmente >90ºC) separa a cadeia dupla de ADN em dois filamentos, sendo este processo conhecido como “desnaturação”. Os dois filamentos ou cadeias de ADN são mantidos juntos por ligações de hidrogénio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações covalentes mais fortes, permanecem intactas.

 

O objectivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de ADN, mas apenas replicar a sequência de interesse (normalmente com tamanhos entre 100 e 600 pares de bases) que é única no organismo. Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleótidos, entre 20 e 30 bases. Numa reacção de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de ADN que foi produzida durante o passo de desnaturação. O início da sequência de ADN alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequência  complementar. Temperatura de annealing ou hibridização: normalmente encontra-se entre 40 ºC e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequências iniciadores se liguem à sequência alvo com elevada especificidade.

 

Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências complementares de ADN, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de ADN. A Taq polimerase é uma polimerase de ADN termo-estável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrário de outras polimerases, se mantém activa a temperaturas elevadas. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleótidos complementares à sequência alvo e utilizando os dNTPs em solução. A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direcção 5’ para 3’.

 

No final do primeiro ciclo da PCR, encontramos duas novas cadeias de ADN idênticas à original. Ponto final: A ADN polimerase não reconhece o final da sequência. Assim, as novas cadeias sintetizadas têm o seu início definido pelo primer, mas a sua extremidade 3’ não está definida, podendo haver fragmentos de diferentes tamanhos. No entanto, no ciclo seguinte, esta cadeia vai servir de molde à síntese de uma nova cadeia, limitando o primer a outra extremidade da cadeia. A cadeia de ADN, sintetizada a partir deste molde, terá então o comprimento definido, com os limites definidos pelos primers. Estas cadeias denominam-se Amplicons. Após alguns ciclos, as cadeias de ADN, que correspondem ao tamanho exacto da sequência alvo, estão presentes num número muito maior do que as sequências de comprimento variável. Por outras palavras, a sequência flanqueada pelos iniciadores ou primers é a secção do ADN que se amplifica.

Reação em cadeia da polomerase

Termociclador, Aparelho utilizado para realizar uma PCR

Reacção em cadeia da polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction - PCR) é um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras.

Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas para diversas tarefas, como o sequenciamento de genes e diagnóstico de doenças hereditárias, identificação de fingerprint genético (usado em testes de paterninade e na medicina forense), detecção de diagnóstico de doenças infecciosas e criação de organismos transgênicos.

A História :

O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993, atribuído o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho. Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo. O método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas, como a detecção de doenças hereditárias, que é a identificação de "impressões digitais" genéticas, a construção de árvores filogenéticas (árvores de relação entre espécies), a clonagem de genes (ver adiante), testes de paternidade, exames para detecção de agentes patogênicos e etc.

Aplicações:

O PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações do PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting. O PCR também é rotineiramente utilizado em procedimentos científicos de Biologia Molecular como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção emplasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizado para identificação de patógenos que estão presentes em amostras como por a exemplo identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia trachomatisHPV Vírus do papiloma humano e seus genótipos, HBV Vírus da Hepatite B. etc O PCR também é utilizado na paleontologia para o sequenciamento genico de animais pré-históricos.

O Procedimento:

Oito tubos de PCR, cada tubo contendo 100μl.

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações.

Resultado da PCR após ser realizada uma eletroforese em gelde agarose ou de poliacrilamida.

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém osdNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, osprimers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96°C por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60°C dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72°C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2ciclos

O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional

Variações da técnica basica de PCR

Nested PCR

Utilizado para aumentar a quantidade de produto amplificado final ou para aumentar a sensibilidade da técnica. Suas reações requerem dois pares de primers, um par mais externo para a 1a reação (round) e outro interno ao produto do 1a reação. A 1a reação necessita de um maior tempo de extensão devido ao maior tamanho do produto a ser amplificado, em seguida adiciona-se uma alíquota da 1a reação, que servirá de molde na mistura (mix) da 1a reação. O produto da 1a reação normalmente não é notado em corrida em gel de agarose, por outro lado o produto da 2a reação gerado em grande quantidade, sim, por isso pode ser visualizado na corrida eletroforética ou utilizado para sequenciamento.

Hot Start

A reação de PCR é ativada quando a temperatura atinge 940C. Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase contém um anticorpo, que se desnatura e ativa a enzima ao atingir a temperatura de 940C. DNA polimerases que não possuem esse inibidor podem amplificar produtos indesejados (inespecíficos) em temperatura ambiente.

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