Apostila de Técnica de Coloração em Gram

Apostila de Técnica de Coloração em Gram

(Parte 1 de 2)

Ministério da Saúde

Secretaria de Políticas de Saúde Programa Nacional de DST e Aids

Técnica de Coloração de GRAM

Brasília 2001

José Serra Ministro de Estado da Saúde

Cláudio Duarte Secretário de Políticas de Saúde

Paulo Roberto Teixeira Coordenador Nacional de DST/AIDS-MS

Miriam Franchini Coordenadora de Produção do Projeto TELELAB

Autores:

Cláudia Renata Fernandes Martins José Antônio Pinto de Sá Ferreira Luiz Fernando de Góes Siqueira Luís Alberto Peregrino Ferreira

Maria Luísa Bazzo Miriam Franchini Oscar Jorge Berro Sílvio Valle

Assessoria Pedagógica: Maria Lúcia Ricciotti Ribinik Martistela Arantes Marteleto

Técnica de Coloraçao de Gram.

Brasilia: Ministerio da Saúde, Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS, 1997. 63 p.: iI. (Série TELELAB) 1. Gram I. Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS, (Brasil). I. Série TELELAB

Os responsavéis pela implatação do TELELAB empenharam toda sua capacidade profissional para tornar este projeto digno da qualidade técnica e científica e da eficiência que nossa coordenadora geral sempre imprimiu às realizações do Programa Nacional de DST/AIDS do Ministério da Saúde.

À Dra. Lair Guerra de Macedo Rodrigues, exemplo de coragem e liderança, dedicamos este trabalho.

Pedro Chequer

APRESENTAÇÃO6
INTRODUÇÃO E MODIFICAÇÕES AO MÉTODO DE GRAM9

PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de Coloração de Gram

GRAM15
material necessário para preparar os corantes17
preparação da violeta-de-metila18
preparação do lugol e da safranina19
armazenamentos dos corantes20
técnica de coloração de Gram20
PRINCÍPIO DE FUNCIONAMENTO23
CONTROLE DE QUALIDADE27
RESULTADOS31
FÓRMULAS37
BIOSSEGURANÇA41 - 63
CONSIDERAÇÕES FINAIS57

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Agora você faz parte do Sistema de Educação a Distância para profissionais da saúde envolvidos com o diagnóstico laboratorial das Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids - DST/AIDS - TELELAB.

O TELELAB foi criado para levar até você cursos com informações indispensáveis para que seu trabalho seja realizado dentro dos padrões de qualidade estabelecidos pelo Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids, do Ministério da saúde - PN-DST/AIDS-MS.

Assistindo ao programa de vídeo e estudando este manual você terá a oportunidade de verificar o que pode ser mudado no seu dia-adia e o que pode ser mantido.

Assim, você terá mais confiança nos resultados do seu trabalho e mais tranqüilidade no que se refere à sua segurança pessoal.

Para esclarecimentos de dúvidas e sempre que precisar, comunique-se diretamente com

Telefax gratuito: 0800 - 61 - 2436

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Ao final deste curso você será capaz de:

• identificar os procedimentos e técnicas recomendados pelo PN-DST/AIDS - MS para preparação dos corantes e para a realização da coloração Gram; e

•executar a coloração de Gram, obedecendo aos critérios técnicos, critérios de controle de qualidade e cuidados de biossegurança recomendados.

Funcionamento do seu curso TELELAB

Agora que você fez a inscrição e o pré-teste, está na hora de se organizar para fazer seu curso! Você tem1mês para concluí-lo.

Assista ao vídeo quantas vezes você precisar. No manual, estão todos os conteúdos para o seu estudo.

Faça o pós-teste e responda ao questionário de avaliação. Suas informações são fundamentais para a melhoria do TELELAB.

Para obter o certificado, você deverá acertar no minímo 80% do pós-teste. Depois da correção do seu teste pelo PN-DST/AIDS, você receberá o certificado.

Inscrição Pré-teste

Vídeo e Manual

Pós-teste

Certificado

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Introdução

O método tintorial predominante utilizado em bacteriologia é o método de Gram. A bacterioscopia, após coloração pelo método de Gram com diagnóstico presuntivo, de triagem, ou até mesmo confirmatório em alguns casos, constitui peça importante e fundamental na erradicação e no controle das Doenças Sexualmente Transmissíveis (DST). Essa técnica é simples, rápida e tem capacidade de resolução, permitindo o correto diagnóstico em cerca de 80% dos pacientes em caráter de pronto atendimento em nível local.

Os custos com investimento e manutenção são consideravelmente baixos diante da eficácia alcançada com os resultados imediatos dos testes. Essa técnica requer instalação simples, necessitando apenas de uma sala pequena com disponibilidade de água e gás, onde deverá ser instalado um balcão com pia e um bico de Busen, eventualmente substituído por uma lamparina ou espiriteira.

São ainda necessários: microscópio com objetiva de imersão e bateria para a coloração de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo próprio laboratório ou por um laboratório habitado que assegure a qualidade do produto.

Finalmente, e mais importante, são necessários técnicos de laboratório treinados, responsáveis e conscientes do valor do seu trabalho.

A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Grampositivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas.

Após descrição do método, inúmeras propostas de modificação foram feitas. Neste manual, você vai conhecer a técnica, os corantes e os procedimentos para a correta realização da coloração de Gram, recomendados pelo Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids do Ministério da Saúde.

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Quais as modificações feitas ao método de Gram?

O método original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza um outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila. É importante ressaltar que a solução de violeta-de-metila, em sua preparação, já contém fixador químico. Devido a isso, a fixação do esfregaço em chama caiu em desuso e é atualmente contra-indicada.

O diferenciador há 100 anos era uma mistura de solventes. Hoje se usa apenas o álcool etílico (9,5º Gay Lussac). Este é mais seguro do que o álcool acetona utilizado por HURK, que requeria grande habilidade do operador para que não ocorresse a hiperdescoloração. Além do que, não permitia uma boa reprodutibilidade da técnica.

Entretanto, a modificação mais importante foi a do corante secundário, também chamado de corante de fundo. A fucsina fenicada de Gram foi substituída pela safranina. Foi baseado no espectro de cores que substituiu a fucsina pela safranina.

A safranina mantém-se mais distante da violeta no espectro de cor, diferenciado com maior nitidez as bactérias Gram-negativas que se destacam das Gram-positivas e da coloração de fundo, que assume a cor vermelho-claro. Veja a figura 1, na página seguinte:

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Violeta

Figura1: representação, no espectro de cores, da distância entre a safranina e a fucsina, em relação à violeta.

SAFRANINA FUCSINA

Quais as diferenças bioquímicas entre a safranina e a fucsina? Corante ÁcidoCorante Básico

Pertencente ao GrupoPertencente ao Grupo das Triarilpirazinasdos Triarilmetanos

Solúvel em ÁguaInsolúvel em Água

Fucsina Safranina

Violeta

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O que é preciso para preparar os corantes de Gram? Para preparar os corantes, você vai precisar de:

• violeta-de-metila;

•álcool etílico (9,5º Gay-Lussac)

•álcool metílico (9,5º Gay-Lussac)

•axalato de amônia;

•iodeto de potássio;

•iodo metálico;

•safranina; e

•água destilada.

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Como preparar a violeta-de-metila? (vide Fórmulas)

A) Primeira solução:

Se você utilizar uma balança gramatária ou eletrônica, coloque o papel de pasagem no prato e pese o papel. Adicione a este valor 2 gramas de violeta-de-metila. Siga atentamente as instruções contidas no manual do equipamento. Assegur-se de que sua balança foi certificada pelo INMETRO.

Transfira a violeta-de-metila para o béquer de 500 ml. Junte 100 ml de álcool etílico e, em seguida, 100 ml de álcool metílico. Misture lentamente com o auxílio do bastão de vidro. Deixe descansar por alguns minutos e repita o procedimento de mistura várias vezes, até conseguir a completa dissolução do corante.

B) Segunda solução:

Pese 4 gramas de oxalato de amônia. No béquer de 1 litro, junte o oxalato de amônia à metade da água destilada (200 ml). Misture lenta e constantemente como na 1ª solução, até conseguir a completa dissolução, observando se não restaram resíduos no fundo do béquer. Você observará que o preparo desta solução vai desencadear uma reação endotérmica, isto é, a solução ficará ligeiramente gelada. Para acelerar o processo de dissolução do sal, você pode aquecer em banho-Maria a 37º C.

C) Preparo final:

Junte as duas soluções (A e B) e utilize o restante da água destilada (200 ml) para recuperar os resíduos da violeta-de-metila no béquer. Deixe descansar por 24 horas e filtre em papel de filtro comum, acondicionando o corante em frasco de vidro escuro, previamente lavado, seco e rotulado.

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Como preparar o lugol? (vide Fórmulas)

Para preparar essa solução, pese 4,5 gramas de iodeto de potássio. Transfira o iodeto de potássio para um béquer contendo 450 ml de água destilada. Com o auxílio de um bastão de vidro, misture até a completa dissolução. Em seguida, pese 3 gramas de iodo metálico e junte à solução de iodeto de potássio. Continue misturando até a completa dissolução. Armazene em frasco de vidro escuro, previamente lavado, seco e rotulado.

Como preparar o lugol diluído para uso?

Em um frasco conta-gotas escuro, junte 2 ml de lugol concentrado com 38 ml de água destilada.

Como preparar a safranina? (vide Fórmulas)

Pese 2,5 gramas de safranina. Dissolva bem o pó em 500 ml de água destilada, misturando bem até conseguir a completa dissolução. Guarde em frasco escuro previamente lavado, seco e rotulado.

Lembre-se

A boa prática laboratorial recomenda a identificação de todos os seus reagentes. Você deve incluir o nome do corante, a concentração e a data de preparação.

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Como armazenar os corantes?

Os recipientes utilizados para os corantes devem ser de cor âmbarescuro, pois, de forma geral, as substâncias corantes sofrem ação da luz, produzindo alterações variadas. Os corantes devem ser colocados em frascos de 1 litro e distribuídos em frascos conta-gotas com cerca de 100 ml de capacidade, para uso diário. Sempre que os frascos conta-gotas forem reabastecidos, filtre o corante. Este procedimento evitará os inconvenientes advindos da precipitação do corante.

Como fazer a coloração de Gram?

Antes de iniciar a coloração, assegure-se de que o esfregaço esteja seco. Não fixe o esfregaço em chama, pois este processo promove a desidratação brusca dos constituintes celulares. Lembre-se de que a violetade-metila já contém fixador químico. Para fazer a coloração, siga os seguintes passos:

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1.Cubra o esfregaço com violeta-de-metila e deixe por aproximadamente 15 segundos;

2.Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta-de-metila e deixe agir por mais 45 segundos;

3.Escorra o corante e lave em um filete de água corrente; Cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto; 4.Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente; 5.Adicione álcool etílico (9,5º GL) sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante; 6.Lave em um filete de água corrente; 7.Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos; 8.Lave em um filete de água corrente; 9.Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo; 10. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço; e 1. Leia em objetiva de imersão (100 X).

Figura 1: material para coloração de Gram.

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Como funciona a coloração de Gram?

Desde o trabalho original de Hans Gram, vários pesquisadores tentaram, com pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no método de coloração. Conceitos diversos têm sido apresentados, tais como:

1.A existência de um substrato Gram-positivo e específico;

2.As bactérias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam diferentes afinidades com o corante primário cristal de violeta; e

3.A existência de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos.

Este último é o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da parede celular, quanto as dimensões dos espaços intersticiais, por exemplo, “diâmetro do poro”, parecem ser determinantes do resultado final da coloração de Gram.

Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares são cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adição do lugol, também chamado de mordente, ocorre a formação do completo iodo-pararosanilina. Esta reação tem a propriedade de fixar o corante primário nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como álcool etílico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou não perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.

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As bactérias que têm a parede celular composta por mureína (peptídeoglicano - peptídeo de ácido n-acetil murâmico), durante o processo de descoloração com álcool etílico, retém o corante. Já as bactérias com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos e lipoproteínas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante de fundo. Veja as figuras 1 e 2.

Figura 1. Esquema da parede das bactérias Gram-positivas

Figura 2. Esquema da parede das bacterias Gram-negativas

Gram +Gram - peptídeoglicano(MUREÍNA) peptídeoglicano (MUREÍNA) membrana citoplasmática membranacitoplasmática espaço periplasmático membrana externa lipopolissacarídeo

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Como fazer o controle de qualidade do método de coloração de Gram?

O controle de qualidade é uma atividade obrigatória da rotina diária.

Para realizar o controle de qualidade dos corantes e da coloração de Gram, você precisa de duas cepas bacterianas: a Gram-positiva deverá ser um Streptococcus pyogenes ATCC - American Type Culture Collection - nº 19.615 e a Gram-negativa deverá ser a Escherichia coli ATCC nº 25.922.

Atenção Para informação sobre a obtenção de cepas-padrão, comunique-se com o:

TELELAB - PN- DST/AIDS- MS Telefax gratuito: 0800 61-2436

Como fazer a manutenção das cepas-padrão?

Para manter as cepas bacterianas do controle de qualidade em seu laboratório, você deverá repicá-las, a cada 15 dias, em ágar nutriente (tubo com ágar inclinado). O controle da pureza das cepas bacterianas deverá ser realizado a cada 2 meses. As cepas deverão ser repicadas em placas (método do esgotamento por estrias) e identificadas segundo procedimentos microbiológicos tradicionais. Após confirmação da pureza das cepas, estas deverão voltar a ser estocadas em tubos com ágar nutriente. O método detalhado e os protocolos de estoque acompanharão as cepas fornecidas por meio do Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids do Ministério da Saúde.

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Como preparar as lâminas de controle de qualidade para uso diário?

Obedeça ao seguinte procedimento.

Prepare uma suspensão de Streptococcus Pyogenes e Escherichia

Coli. Para isso, pipete 2 ml de solução salina estéril em um tubo de ensaio limpo e estéril. Junte uma alçada do Streptococcus Pyogenes e outra de Escherichia Coli. Muita atenção com os procedimentos técnicos e cuidados de biossegurança durante a execução. Flambe a alça bacteriológica antes e após a utilização com cada uma das cepas bacterianas. Não se esqueça de esfriar a alça após a flambagem.

Prepare 30 lâminas para utilizar durante 1 mês, pipetando uma gota da suspensão bacteriana sobre cada uma das lâminas de vidro, limpas, secas e desengurduradas. Deixe as lâminas secarem naturalmente. Estoque-as em um porta-lâminas em temperatura ambiente. Lembre-se de identificar o porta-lâminas.

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