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Ciclo do Ácido Cítrico

Capítulo 7

7 Ciclo do Ácido Cítrico

Objetivos

1. Descrever a obtenção de acetil−CoA pela descarboxilação oxidativa do piruvato nas mitocôndrias.

2. Reconhecer que o ciclo do ácido cítrico é a via de oxidação do grupo acetila da acetil−CoA com formação de três NADH e de um FADH2 além da formação de um ATP (ou GTP) por fosforilação ao nível do substrato.

3. Identificar a reação catalisada pela citrato−sintase como a primeira reação do ciclo do ácido cítrico e reconhecer as substâncias participantes.

4. Identificar as substâncias participantes das reações do ciclo do ácido cítrico catalisadas por: isocitrato−desidrogenase, complexo do α−cetoglutarato, succinil−CoA−sintetase (succinato−tiocinase), succinato desidrogenase e malato −desidrogenase .

5. Explicar a reação catalisada succinil−CoA−sintetase (succinato tiocinase) na formação de ATP ao nível do substrato.

6. Calcular o número de compostos de “alta energia” (ATP) sintetizados pela oxidação de um mol acetil−CoA no ciclo do ácido cítrico.

7. Descrever os mecanismos de regulação do ciclo do ácido cítrico. 8. Descrever a entrada e saída de intermediários do ciclo do ácido cítrico.

O ciclo do ácido cítrico (também chamado de ciclo de Krebs ou ciclo dos ácidos tricarboxílicos) é o estágio final da oxidação dos combustíveis metabólicos. Os átomos de carbono entram no ciclo na forma de grupos acetila derivados dos carboidratos, ácidos graxos e aminoácidos. O grupo acetila ligado a coenzima A (acetil-CoA) é oxidado em oito reações mitocondriais para formar duas moléculas de

CO2 com a conservação da energia livre liberada em três moléculas de NADH, uma de FADH2 e um composto de “alta energia” (GTP ou

ATP). O NADH e o FADH2 são oxidados e os elétrons são conduzidos pela cadeia mitocondrial transportadora de elétrons com a liberação de energia conservada na forma de ATP sintetizado a partir de ADP e

Pi por meio de processo denominado fosforilação oxidativa (ver Capítulo 8). A reação líquida para o ciclo do ácido cítrico é:

192 • MOTTA • Bioquímica Quadro 7.1 Descoberta do ciclo do ácido cítrico

A operação do ciclo do ácido cítrico foi deduzida por Hans Krebs em 1937 a partir de observações sobre a velocidade de consumo de oxigênio durante a oxidação do piruvato por suspensões de músculos peitorais de pombos. Esses músculos ativos no vôo, exibem uma velocidade de respiração muito alta e são apropriados para as investigações metabólicas. O consumo de oxigênio foi monitorado com o auxílio de um manômetro, um aparelho que permite a medida das alterações no volume de um sistema fechado a pressão e temperatura constantes. Estudos anteriores, principalmente os realizados por Albert Szent−Györgyi (1935), mostraram que o succinato, o fumarato, o malato e o oxaloacetato estimulavam o consumo de oxigênio por esses músculos. Krebs mostrou que o piruvato também aumentava o consumo de oxigênio.

Além disso, ele também observou que a oxidação do piruvato podia ser grandemente estimulada pelo oxaloacetato, cis-aconitato, isocitrato e α-cetoglutarato. Os efeitos dessas substâncias eram completamente suprimidos pela adição de malonato, um inibidor competitivo da succinato−desidrogenase. A adição do malonato também acumulava citrato, α−cetoglutarato e succinato. Pelo fato da adição do piruvato e oxaloacetato à suspensão ter resultado no acúmulo de citrato, Krebs concluiu que a via operava como um ciclo. Somente em 1951 foi demonstrado que a acetil-CoA é o intermediário que condensa com o oxaloacetato para formar citrato.

Krebs publicou sua descoberta no periódico

Enzimologia já que a revista Nature recusou o artigo original.

Acetil−CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O → 2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + CoASH + GTP + 3 H+

Além do papel na geração de energia, o ciclo do ácido cítrico também é fonte de unidades monoméricas para a biossíntese de carboidratos, lipídeos e aminoácidos não-essenciais.

Nesse contexto será examinado como o piruvato, derivado da glicose e outros açúcares através da via glicolítica, é oxidado à acetil−CoA e CO2 para entrar no ciclo do ácido cítrico (Figura 7.1). O piruvato atravessa a membrana externa da mitocôndria via canais aquosos de proteínas transmembranas chamados porinas (ver Seção 9.4). A piruvato−translocase, uma proteína da membrana mitocondrial interna, transporta especificamente o piruvato do espaço intermembrana para a matriz mitocondrial em simporte com o H+ (ver Seção 9.4.B).

Ciclo do ácido cítrico 2CO2 GTP

Acetil-CoA

CO2 2e

Piruvato

Figura 7.1 Associação da glicólise e o ciclo do ácido cítrico. O piruvato produzido na glicólise é convertido em acetil−CoA, o combustível do ciclo do ácido cítrico. Os elétrons removidos são transportados pelo NADH e FADH para a cadeia mitocondrial transportadora de elétrons no interior das mitocôndrias

7 Ciclo do ácido cítrico • 193 que fornece energia para a síntese de ATP.

7.1 Oxidação do piruvato a acetil−CoA e CO2

Sob condições aeróbicas, o piruvato presente na matriz mitocondrial é convertido em CO2 e um fragmento de dois carbonos, a acetil−CoA em reação de descarboxilação oxidativa. A reação é catalisada pelo complexo da piruvato−desidrogenase constituído por três enzimas distintas: a piruvato−desidrogenase (E1), a diidrolipoil−transacetilase (E2) e a diidrolipoi−desidrogenase (E3) associadas de modo não-covalente e cinco diferentes coenzimas. O complexo está localizado exclusivamente na mitocôndria das células eucarióticas. Devido a grande energia livre padrão negativa dessa reação sob condições fisiológicas, o processo é irreversível o que impede a reação inversa de formação do piruvato a partir do acetil−CoA.

A operação do complexo da piruvato desidrogenase requer cinco coenzimas cujos papéis funcionais são descritos a seguir.

1. Descarboxilação oxidativa do piruvato. A reação requer o co-fator pirofosfato de tiamina (TPP) ligado à enzima piruvato−desidrogenase (E1). O TPP ataca o carbono da carbonila do piruvato e libera o CO2 deixando o grupo hidroxietil ligado ao TPP para formar o hidroxietil−TPP (HETTP).

2. Transferência do grupo hidroxietil do HETTP para a diidrolipoil−transacetilase (E2). O aceptor do hidroxietil é o

HO C CH3
OC C CH3

CH3

CO

CH3

CH3

Piruvato Hidroxietil-TPP

Citosol Matriz mitocondrial

Complexo piruvato desidrogenase COO

CO

Piruvato translocase

HS-CoA CO2 S-CoA

CO

CH 3 Piruvato Acetil-CoA

Piruvato

194 • MOTTA • Bioquímica grupo prostético lipoamida. A reação de transferência regenera o TPP da E1 e oxida o grupo hidroetil a um grupo acetila.

3. Transferência do grupo acetila para a coenzima A, em reação catalisada pela diidrolipoil−transacetilase.

4. Regeneração do complexo da piruvato−desidrogenase original. O grupo diidrolipoato da E2 é reduzido pela flavina adenina dinuclotídeo (FAD) em presença de diidrolipoil−desidrogenase com a regeneração do lipoato.

CoASH

C O CH3

Coenzima A Acetil CoA

CoAS C CH3
HO C CH3

CH3

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