Apostila de Micologia, Notas de estudo de Algas e Fungos

Baixe Apostila de Micologia e outras Notas de estudo em PDF para Algas e Fungos, somente na Docsity! APOSTILA CURSO DE MICOLOGIA MÉDICA 1.- Introdução Identificação dos fungos Generalidades Os fungos são organismos eucarióticos, desprovidos de clorofila e de celulose, uni ou pluricelulares sem a capacidade de formar tecido, imóveis na sua maioria. Cada célula pode gerar, por si só, um novo organismo da mesma espécie. São considerados os principais biodegradradores de matéria orgânica de nosso planeta. As células fúngicas apresentam morfologia variável, mostrando grande diferença em tamanho, estrutura e atividade metabólica, formando diferentes tipos de colônias quando cultivados em meios apropriados, estruturas de frutificação complexas e/ou elaborados mecanismos de propagação e dispersão. REINO PROTOZOA: Rhinosporidium seeberi REINO CHROMISTA: Pythium insidiosum Os fungos são organismos distintos das bactérias em tamanho, estrutura celular e composição química. Os fungos são eucariontes isto é possuem núcleos envolvidos por membrana própria, heterotróficos, com nutrição de absorção, uni ou pluricelulares, com parede formada de polissacarídeo incluindo glucanas, mananas, quitina bem como glicoproteínas, sem celulose. A composição desses compostos é variável e depende da posição sistemática dos fungos, ergosterol é o principal componente da membrana fúngica. A célula fúngica é constituída pelos componentes encontrados em outros organismos eucarióticos. As organelas citoplasmáticas e inclusões são: mitocôndrias, vacúolos, vesículas, retículo endoplasmático, microtúbulos, ribossomos e cristais de glicogênio. Os típicos aparelhos de Golgi irão estar sempre presentes. Quase todos os fungos são aeróbios e todos necessitam matéria elaborada para sua alimentação (heterotróficos). Os fungos não ingerem seu alimento, mas possuem nutrição de absorção e parasitam seres vivos ou atacando matéria morta como sapróbios, parasitas, simbiontes ou patógenos. Os fungos se desenvolvem em meios de cultivos especiais, formam colônias que são classificadas em dois tipos principais, leveduriformes e filamentosas, que se diferenciam pela macromorfologia e micromorfologia. 2.- Coleta de Material Biológico A coleta de material biológico é a primeira etapa no processo de identificação dos fungos. Quando realizada incorretamente, dificulta a observação, isolamento e identificação do agente causal da doença. O primeiro passo consiste em obter os dados do paciente: nome, idade, RG, procedência, endereço, telefone para contato, entre outros; dados epidemiológicos: profissão, contato com animais, doença associada, estado imunológico, etc; informações clínicas: local anatômico acometido, aspecto da lesão, suspeita clínica, antibioticoterapia prévia, evolução e dados do médico responsável. O procedimento de coleta varia segundo a região acometida, suspeita clínica e tipo de material biológico. A quantidade de amostra coletada deve ser suficiente para permitir o procedimento de identificação laboratorial do fungo: como exame microscópico direto e cultivos em vários meios, com eventuais repetições desses exames para confirmação dos achados laboratoriais. Procedimento da coleta Para efeitos práticos, a coleta de material biológico, depende da localização e do tipo da micose. Amostras de micoses superficiais e cutâneas Também denominadas dermatomicoses acometem: pele, pêlo, unhas, provocando algumas delas alterações somente de importância estética. A.- Amostras de pele. A prévia desinfecção da lesão com algodão embebido em álcool 70% diminui a biota bacteriana, aumentando a sensibilidade do exame micológico. Raspar a lesão com bisturi, cureta esterilizada ou com lâminas de vidro previamente flambadas. Nas lesões sugestivas de dermatofitose, a coleta deve ser feita nas bordas da lesão, já que este é o sitio ativo da infecção. Quando o raspado da lesão não pode ser realizado, pode-se optar por métodos tais como o de Porto (só para pitiríase versicolor) que consiste em utilizar uma fita adesiva transparente (Durex) que é pressionada sobre a lesão, removida e fixada sobre uma lâmina ou a utilização de um tapetinho estéril de aproximadamente 4 cm que e pressionado sobre a lesão, embrulhado e transportado ao laboratório (Mariat & Tapia, 1966). As desvantagens são a falta do cultivo ao empregar a técnica de Porto e do exame direto, quando se usa o tapetinho. B.- Amostras de unha. A lesão pode-se localizar na região subungueal distal, proximal ou lâmina superficial da unha. A tomada amostra dependerá do tipo de lesão. Deve-se remover a presença de esmalte antes da coleta. Na onicomicose superficial branca, raspa-se as áreas esbranquiçadas da parte superficial com o auxilio de bisturi estéril. No acometimento sub-ungueal, deve-se raspar profundamente a área infectada desde a porção distal à proximal. Os primeiros detritos coletados da porção distal deverão ser eliminados já que são ricos em contaminantes. As escamas obtidas da porção profunda da lesão poderão ser usadas para o exame micológico. Quando as unhas são distróficas, pode-se auxiliar a coleta com tesouras limpas e desinfetadas. C.- Amostras de cabelo e pêlo. Nos casos de piedras cortam-se com tesoura os cabelos ou pêlos apresentando nódulos fúngicos (observados com auxilio de lupa). Nas tinhas do couro cabeludo e da barba, as amostras podem incluir escamas da pele e os pêlos ou cabelos alterados. Os cabelos opacos e engrossados são facilmente arrancados, a partir das bordas das placas alopécicas com ajuda de uma pinça limpa e flambada. Os pêlos, escamas de pele ou de unhas, podem ser colhidos e transportados entre duas lâminas de vidro limpas, secas e flambadas, embrulhadas em papel, ou em placas esterilizadas, sempre com a identificação da amostra. D.- Amostras oculares. Material de conjuntiva é colhida da mucosa, desde a porção proximal em direção a borda, com "swab" estéril, embebido em solução salina. O "swab" pode ser colocado num tubo estéril, contendo meio semi-sólido de transporte ou 0,5ml de solução salina. Material ocular (córnea) colhido só por oftalmologistas, raspando as áreas necróticas, ulceradas e supurativas da lesão com espátula esterilizada. Esta amostra será processada em lâmina (exame microscópico direto) e semeada imediatamente nos meios de cultivo apropriados ou tubo estéril contendo solução salina. E.- Amostras óticas. Geralmente o material biológico é obtido a partir do conduto auditivo externo, com “swab” esterilizado umedecido previamente em solução salina. E.- Mucosas. i- Mucosa oral. As amostras devem ser obtidas por raspado da superfície epitelial acometida, empregando espátula ou bisturi rombo esterilizado. Na candidíase oral em que se verificam placas esbranquiçadas, o material pode ser colhido com “swab” estéril, ou alça de platina, colocar em tubo esterilizado contendo solução salina. ii- Mucosa nasal. O material nasal pode ser colhido com espátula, bisturi, alça ou ¨swab¨. Nos casos de suspeita de aspergilose, feohifomicose, zigomicose ou rinosporidiose, recomenda-se coleta do material com procedimento cirúrgico, como biópsia, etc. iii- Mucosa vaginal. As amostras de fluxo vaginal se tomam sem asseio prévio da paciente, com “swab”, colocar em um tubo com solução salina esterilizada. iv- Mucosa genital Masculina. A amostra pode ser colhida com swab da área da glande que apresenta pontos esbranquiçados ou pseudomembranas, ou do prepúcio em onde podem ser encontradas, Devem ser obtidas amostras representativas da patologia suspeita. O material deve ser dividido em dois frascos estéreis diferentes, um contendo formol ao 0.4% e outro contendo solução salina, destinados ao exame histopatológico e micológico, respectivamente. C.- Medula óssea. É um procedimento médico que exige rigorosa assepsia. Podem ser obtidas 2-3 ml do material com seringa com heparina, que deve ser transportado imediatamente ao laboratório micológico. D.- Líquido cefalorraquídiano (LCR) Para o estudo micológico devem ser colhidos 5 a 10 ml de LCR, obtido por punção lombar, em condições de rigorosa assepsia. O LCR é normalmente, livre de microrganismos. Qualquer agente observado deve ser considerado como um patógeno potencial. E.- Sangue Realizar assepsia do sitio escolhido para puncionar com álcool 70 % esperar 5 segundos e aplicar solução de Iodo-povidine a 10%, coletar de 8 a 10 ml de sangue venoso (adultos) e de 1 a 3 ml (crianças), para cada frasco coletado. Terminada a punção retirar a agulha trocando-a por uma nova, inocular o sangue no frasco enviando de imediato ao laboratório. Número e intervalo das amostras: -Suspeita de septicemia: colher duas amostras de sangue de diferentes locais com intervalo de uma hora. -Febre de origem desconhecida: colher duas amostras com intervalo de uma hora. Se forem negativos, após 24 a 36 h, colher as outras duas amostras com intervalo de 1 hora. F.-Urina A assepsia com água e sabão da região genital deve ser rigorosa pudendo após lavar com povidine, enxugar com água estéril e secar com gaze estéril. (sexo masculino retrair o prepúcio e lavar a zona do glande e meato urinário) Coletar 10 ml de urina do segundo jato urinário (sexo feminino afastando os grandes lábios) em frasco esterilizado. Crianças: Fazer assepsia rigorosa dos genitais e região perianal com água e sabão, colocar o coletor urinário adequado segundo sexo, uma vez obtida a amostra mandar o coletor fechado ao laboratório. (o coletor deverá ser trocado a cada 30-40 minutos caso a criança não tenha urinado) Paciente com sonda vesical de permanência: Desprezar a urina remanescente na sonda vesical permitindo a descida desta para a bolsa coletora, pinçar a sonda vesical 20 cm de distal a proximal logo que a urina fresca se acumule. Prévia assepsia com álcool 70 %, coletar 10 ml da amostra puncionando no lugar do dispositivo para coleta de urina, e depositar em tubo esterilizado adequadamente fechado e transportar ao laboratório. (no caso da sonda urinária não apresentar dispositivo para coleta de urina é recomendável desligar a sonda vesical do sistema de drenagem e obter amostra de urina mediante gota a gota diretamente no frasco estéril. Todo o procedimento deverá ser realizado respeitando as normas de assepsia). G.- Fezes. Aproximadamente 20g de fezes recém emitidas devem ser coletadas em frasco esterilizado e enviadas rapidamente ao laboratório. Para cultivo de vigilância, utiliza-se “swab” anal. H.- Outros líquidos corporais. Todos os líquidos corpóreos são obtidos por aspirações percutânea ou drenagem, empregando procedimentos invasivos praticados pelo médico. Deve ser coletado tanto líquido quanto seja possível 2 a 10 ml ou mais, pois as concentrações dos microrganismos podem ser muito baixas e coletadas em recipientes com tampa rosca contendo heparina 1:1000. Todas as amostras de material clínico devem ser colhidas adequadamente, em condições ideais e transportadas rapidamente ao laboratório, com a solicitação do tipo de exame, suspeita clínica, dados clínicos e epidemiológicos do paciente, para processamento micológico imediato. 3.- Exame Microscópico Direto e Cultura O exame microscópico direto de material clínico é um dos procedimentos mais simples e úteis para o diagnóstico laboratorial de infecções fúngicas. Vários clarificadores podem ser usados, sendo KOH a 10 ou 20% o mais empregado. A observação de elementos fúngicos em escamas de pele, pêlos ou unhas pode proporcionar uma clara indicação do tipo de micoses envolvida: dermatofitose, candidíase ou pitiríase versicolor. O exame microscópico direto de fluidos, biópsia ou outro material clínico pode também estabelecer o diagnóstico de uma micose sistêmica, orientando a etiologia da infecção como paracoccidioidomicose, histoplasmose, zigomicose, hialohifomicose, feohifomicose entre outras. Técnica: Colocar parte do material biológico a ser estudado sobre lâmina limpa, adicionar uma a duas gotas de KOH a 20%, cobrir com lamínula e flambar ligeiramente. As lâminas previamente marcadas serão colocadas em câmara úmida, “overnight” a 4 °C e posteriormente se realizará a segunda observação microscópica. Nunca se deve pressionar a lamínula com os dedos, uma vez que os ácidos graxos naturais da pele dificultam a observação. Quando a amostra é muito espessa é aconselhável pressionar a lamínula com uma pinça ou outro objeto. O fungo pode ser então liberado do material biológico, o que permite sua visualização. A adição de tinta Parker (Quink) azul permanente ou tinta Scheaffer 22 ao KOH, permite melhor visualização e contraste dos fungos em especial das células de Malassezia furfur que se tingem mais intensamente do que outras estruturas fúngicas. Onicomicose borda livre fina e de borda periungueal (candidíase) Escamas lâmina interna da unha e do arco periungueal Células leveduriformes e/ou pseudohifas Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar** Candida albicans, Candida spp. Cromomicose Crostas, secreção ou pus. Estruturas globosas de cor marrom, de parede grossa, septada em dois planos (corpos escleróticos) ou talo moriforme. Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar** Phialophora spp, Cladosporium spp, Rhinocladiella spp. Fonsecaea spp. Esporotricose Secreção ou pus Leveduras alongadas como charuto, o observadas raramente. Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**. Sporothrix schenckii Eumicetoma Secreção ou pus Grânulos parasitários formados por aglomeração de hifas claras ou escuras Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**. Madurella spp (grãos escuros), Pseudallescheria boydii (grãos claros), Acremonium spp, P. romeroi Rinosporidiose Descarga nasal ou tecido do pólipo Esférulas até 350 paredes espessas em diversos graus de maturação Rhinosporidium seeberi Lobomicose Material de lesão queloides e tumores Células leveduriformes tamanho uniforme 9-10 um. Uma ponte tubular une uma célula a outra Glenosporella loboi, Loboa loboi, P. loboi Feohifomicose Secreção ou pus Hifas escuras septadas, elementos leveduriformes, sem corpos escleróticos Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar** Phialophora spp, Cladosporium spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp. Zigomicose subcutânea Nódulos subcutâneos Hifas largas não septadas com reação eosinofílica (corte) Sabouraud-dextrose ágar*; Conidiobolus coronatus, Basidiobolus haptosporus Paracoccidioido micose Escarro, pus, raspado de mucosa, etc. Células esféricas de tamanho variável de membranas duplas com um ou muitos brotamentos, células esfericas isoladas, células caten., Células caliciformes. Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar** Paracoccidioides brasiliensis Histoplasmose Escarro, raspado das lesões. Células leveduriformes F 0 6 Dpequenas 2-3 m, esféricas ou ovaladas no interior de macrófagos ou mononucleares (coloração com Giemsa). Sabourad-dextrose ágar*;Lactrimel ágar, Histoplasma capsulatum Criptococose L.C.R., escarro, pus, etc Células leveduriformes esféricas com cápsula grande (em observação com tinta da China) Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar**. Cryptococcus neoformans Candidíase Raspado mucosa, biopsia, escarro, etc. Células leveduriformes ou pseudohifas Sabouraud-dextrose ágar*; Lactrimel ágar**. Candida albicans, Candida spp. Otomicose Pseudomembrana com pontos de cores ou massa em migalha de pão Filamentos com ou sem cabeças aspergilares ou células leveduriformes e pseudohifas Sabouraud-dextrose ágar**; Lactrimel ágar**. Aspergillus niger, A. Fumigatus, Aspergillus spp, Candida albicans, etc.. * Meio adicionado de Cicloheximida e cloranfenicol.; ** Meio adicionado de cloranfenicol Micologia médica, micoses e seus agentes Em micologia médica, as micoses são divididas para seu estudo em: Micoses superficiais Os agentes de micoses superficiais, formam um grupo heterogêneo de fungos que não sensibilizam o indivíduo, não provocam reações alérgicas a distancia como os agentes de micoses cutâneas. Malassezia furfur, Hortae werneckii, Trichosporon spp., Piedraia hortae são os fungos envolvidos nessas micoses. Malassezia furfur - Agente da pitíriase versicolor, afecção cutânea assintomática que se caracteriza por placas descamativas de diferentes cores: castanho-avermelhadas, PAGE 19 Candidíases São causadas primordialmente por C. albicans, embora outras espécies de Candida estejam se tornando cada vez mais importantes como agentes etiológicos. A C. albicans existe como normal no trato gastrointestinal, na área vulvovaginal, na pele e fezes. Em casos de comprometimento imunológico e conseqüente queda da resistência causados por AIDS, neoplasias, lúpus eritematoso, tuberculose ou terapias com esteróides ou agentes citotóxicos, as leveduras podem proliferar e causar auto-infecções. As candidíases atingem principalmente as mucosas, exemplo candidíase oral. broncopulmonar, vulvovaginal; candidíase mucocutânea crônica, cutânea, ungueal, etc. são algumas das manifestações que podem ocorrer. Micoses subcutâneas Os agentes de micoses subcutâneas, tem habitat no solo. Podem ocorrer micoses subcutâneas quando há traumatismo por espinhos ou outro tipo de vegetação ou materiais contaminados por fungos. Os organismos alojam-se na pele e passam a produzir infecção localizada na pele e no tecido subcutâneo e às vezes nos linfonodos da região. Raramente a infecção se se dissemina. As lesões subcutâneas caracterizam-se pela cronicidade de áreas duras, nodulosas, crostosas e ulceradas. Que não cicatrizam e periodicamente produzem exsudação. Os membros inferiores, sobretudo os pés, são muitas vezes comprometidos, visto que seu contato com espinhos e outros vegetais é mais freqüente. Esporotricose – Esta infecção decorre de ferimentos cutâneos provocados por materiais contaminados, como espinhos de flores, gravetos, madeira, etc. Produz lesões ulcerativas subcutâneas, nos membros, que podem avançar ao longo dos vasos linfáticos. A esporotricose pulmonar está sendo observada com mais freqüência, deve ser distinguida da tuberculose, coccidioidomicose, histoplasmose e sarcoidose. O agente etiológico é Sporothrix schenckii, fungo dimórfico. Cromoblastomicose – As lesões produzidas evoluem com grande lentidão torna-se, vão-se formando muitas protuberâncias sobrepostas, o que cria a aparência de couve-flor. Geralmente, a erupção é seca, mas pode ulcerar-se. Na suas camadas mais profundas, encontram-se corpos escleróticos. PAGE 19 Os principais agentes envolvidos: F. pedrosoi, F. compacta, P. verrucosa, C. carrionii, Rhinocadiella aquaspersa. Micetomas – O micetoma geralmente se restringe aos pés, mas pode ser visto em outras regiões como mãos e nádegas. Os nódulos, que periodicamente exsudam um líquido oleoso contem grãos que podem ser brancos, amarelos, vermelhos ou pretos. Aos poucos as lesões comprometem toda a perna. A infecção causada pelos fungos superiores (micetoma eumicótico) produz lesões fistulosas, com pouca dor ou destruição óssea, enquanto a causada por bactérias fungiformes (micetoma actinomicótico) apresenta lesões tumorosas cônicas semelhantes às erupções de acne, com grande exsudação e comprometimento ósseo com dor. Principais agentes de micetoma eumicótico: Scedosporium apiospermum, Acremonium falciforme, Acremonium recifei, Exophiala jeanselmei, Madurella mycetomatis, Madurella grisea. Principais agentes de micetoma actinomicótico: Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia otitidiscavarium, Actinomadura madurae, Actinomadura pelletierii, Streptomyces somaliensis, Actinomyces israelii e Actinomyces bovis. Rinosporidiose – doença que se caracteriza pela formação de granuloma vegetante, poliposo, com sede predominantemente nasal ou ocular. (conjuntiva palpebral, conjuntiva bulbar e saco lacrimal). Já foram verificados casos de localização vaginal, retal e peniana, assim como no conduto auditivo externo. Agente etiológico Rhinosporidium seeberi que não tem sido cultivado. Entomoftoromicose ou zigomicose subcutânea – Granuloma eosinofilico causados por zigomicetos que invadem primariamente a gordura do tecido celular subcutâneo. É comum em crianças, traduzindo-se pelo aparecimento de um nódulo subcutâneo que aumenta em volume, provocando intumescimento extensivo, progressivo e lento. Geralmente o paciente não apresenta imunodepressão Agentes envolvidos pertencentes aos gêneros Conidiobolus e Basidiobolus. PAGE 19 Doença de Jorge Lobo – dermatose que provoca lesões tipo quelóides com ausência de comprometimento visceral, ausência de adenopatia satélite, longa evolução do processo. Nem sempre as lesões cutâneas assumem aspecto puramente queloidiano ao lado e lesões papulosas, nodulares, verrucosas, e tuberosas podem ocorrer. Agente etiológico, Lacazia loboi (Loboa loboi) ainda não cultivado. Micoses sistêmicas Os fungos que causam micoses sistêmicas vivem em forma sapróbia no solo. Alguns animais de vida silvestre são reservatórios importantes. Os indivíduos podem desenvolver a doença principalmente por inalação de propágulos. Todos os agentes de micoses profundas apresentam dimorfismo térmico. Na natureza e nos cultivos a 25F 0B 0C, formam colônias filamentosas com reprodução assexuada. Nos tecidos e cultivos a 37F 0B 0C eles apresentam sua forma leveduriforme. Estes fungos são taxonomicamente heterogêneos: Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis. Histoplasma capsulatum – é agente de infecção relacionada a indivíduos que visitam grutas ou lugares com morcegos. 90-95% dos casos são assintomáticos ou sub- clínicos e os sintomas respiratórios gripais se resolvem espontaneamente. Esporadicamente algum paciente pode apresentar uma forma pulmonar aguda da doença, com suores noturnos, tosse, febre e emagrecimento. É fulminante em pacientes com imunodeficiência. Paracococcidioides brasiliensis – a infecção geralmente se caracteriza por lesões pulmonares semelhantes às da tuberculose e de outras micoses. Lesões nas mucosas nasais, oral, pele e outros órgãos podem ocorrer. Blastomyces dermatitidis – O microrganismo ao ser inalado, produz infecção respiratória crônica e branda, que piora gradualmente, ao longo de semanas ou meses. Escarro torna-se purulento, sanguinolento. A fase respiratória da doença tem semelhanças com tuberculose, coccidioidomicose, paracoccidioidomicose e histoplasmose. Pode provocar lesões subcutâneas, ósseas, etc. PAGE 19 podem calcificar. Muitos pacientes apresentam infiltrados densos pulmonares. Na disseminação ocorre infecção hepato-esplênica, osteomelite, comprometimento subcutâneo e nódulos cutâneos semelhantes ao molusco contagioso. A meningites é a forma grave da doença foi atinge grande parte de indivíduos com AIDS. Agente etiológico: Cryptococcus neoformans var neoformans, Cryptococcus neoformans var gattii, com os sorotipos A, B, C, D. Candidíse, Trichosporonose e Malasseziose – descritos anteriormente. Leveduroses por: Geotrichum candidum – Produz infecções orais com placas brancas semelhantes às de candidíase, ao passo que a forma intestinal da doença provoca colite e fezes sanguinolentas. As manifestações bronquiais são as mais comuns; tosse crônica e o escarro mucóide e sanguinolento que provocam lembra tuberculose. Já foram documentadas infecções vaginais. Toluropsis glabrata – patógeno oportunista que geralmente provoca doenças em pacientes debilitados. Os pulmões e os rins são os órgãos mais afetados, embora esse fungo possa disseminar-se para o restante do corpo através do sangue, causando fungemia e choque séptico. Pneumocystis carinii – Pneumocystis se adere às células epiteliais e penetram ao citoplasma, aumentando a permeabilidade capilar do alvéolo, produzido danos na membrana basal do alvéolo formando exudado alveolar eosinofílico. O agente não tem sido cultivado. PAGE 19 4.- Identificação dos Fungos PRINCIPAIS CARACTERISTICAS MACROMORFOLOGICAS DOS FUNGOS 4.a- Identificação dos Fungos Os caracteres macromorfológicos da colônia fúngica podem variar consideravelmente entre um meio de cultivo e outro, dependendo da constituição nutricional ou devido a diferentes tempos e temperaturas de incubação. Conseqüentemente é fundamental em que meio e condições foi incubado o agente. A análise macroscópica dos cultivos visa caracterizar. 1- Textura: serosa, cremosa, mucóide, membranosa, pulverulenta, granular, camurça, cotonosa. 2- Topografia: plana, convexa, umbilicada, pregueada, cerebriforme. 3- Aspecto: brilhante, opaco, seco, úmido. 4- Superfície: lisa, fissurada, rugosa. 5- Bordas: regulares, irregulares, radiadas. 6- Cor da colônia: branco, preto, verde, vermelho, etc. 7- Pigmento: presença ou ausência, cor do pigmento, difuso ou restrito à colônia. 8- Tempo de crescimento. 9- Diâmetro da colônia. Técnica de esgarçamento: PAGE 19 Utilizada para identificação micromorfológica de fungos filamentosos. Com alça de platina em L, retirar um fragmento da colônia, colocar em lâmina com una gota de lactofenol azul de algodão e com auxilio de agulhas esgarçar bem. Cobrir com lamínula, comprimir levemente e observar ao microscópio com aumento 10X ou 40X. Cultivo em lâmina. Nesta técnica as estruturas permanecem devem permanecer íntegras e o meio utilizado pode ser Sabouraud dextrose ágar, batata ágar, lactrimel ágar ou V8. Esterilizar placas de Petri com uma lâmina no interior, papel de filtro e lamínula. Colocar o meio de ágar em placa. Deixar solidificar. Com a alça em L, destacar porções bem pequenas da colônia do bolor, crescida no ágar e colocar nos quatro lados do pedaço de ágar. Cobrir com lamínula esterilizada, pressionando levemente. PAGE 19 ll - Prova do tubo germinativo 1 - Princípio: Esta é uma prova presuntiva para Candida albicans. O tubo germinativo é formado dentro de 2 horas por C. albicans, mas outras espécies, como Candida tropicalis podem produzi-lo após 3 horas. Aproximadamente 95% das amostras de C. albicans são positivas. O tubo germinativo difere da pseudo-hifa por não ser septado, apresentar paredes paralelas e não possuir constrição na sua extremidade “abaulada”. 2 - Material utilizado: - 0,5 mL de soro humano, de cavalo, de carneiro, etc. - pipetas Pasteur - lâminas - lamínulas 3 - Técnica: Semear cultivo de 24-48 horas, em tubo contendo 0,5 mL de soro. Incubar a 37F 0B 0C durante duas horas. Adicionar uma gota da suspensão com pipeta Pasteur em lâmina e cobrir com lamínula. Examinar ao microscópio com objetivas de 10 x e 40x. 4 - Estruturas observadas ao microscópio: PAGE 19 lll - Prova do clamidoconídio (microcultivo) 1 - Princípio: Observar a existência ou não de filamentação, a produção de clamidoconídios, blastoconídios e de artroconídios, assim como a disposição destes elementos no micélio. C. albicans produz clamidoconídios arredondados em posição intercalar ou terminal em relação à pseudohifa. De modo geral, a maioria das espécies do gênero Candida formam pseudohifas bem desenvolvidas. Já as leveduras dos gêneros Torulopsis, Rhodotorula e Cryptococcus não produzem pseudohifas. Algumas leveduras ascosporadas apresentam pseudohifas rudimentares ou não as formam. A presença de artroconídios é sugestiva de Geotrichum spp. ou Trichosporon spp, este último associado a blastoconídios. 2 - Material utilizado: - Cultivos de 24-48 horas - Ágar fubá - Placas de Petri (90x15 mm) - Alça de platina com extremidade retilínea - Lamínulas esterilizadas 3 - Técnica: Fundir o meio de ágar fubá e verter sobre placa de Petri. Após a solidificação, com o auxílio de uma alça de platina, fazer 3 estrias finas, paralelas na superfície da placa e cobrir com lamínula esterilizada. Incubar a 25F 0B 0C, durante 48-96 horas. Examinar ao microscópio, com objetivas de 10 x e 40x. 4 - Observação ao Microscópio: PAGE 19 IV - Prova de assimilação de fontes de C e N (auxanograma) 1- Princípio O teste de assimilação indica a habilidade de uma levedura para utilizar um composto na presença de oxigênio. Cada espécie possui seu padrão próprio de assimilação. Essas provas são muito sensíveis e úteis para a identificação das leveduras. Estão condicionados a fatores de permeabilidade, sistemas enzimáticos que catalisam a degradação dos hidratos de carbono e ao sistema redutase que intervêm na redução do nitrato. 2- Material utilizado - Cultivo de 24-48 horas - Meio C - Meio N - Placas de Petri 150 x15 mm esterilizadas - Placas de Petri 90 x 15 mm esterilizadas - Fontes de carbono (dextrose, maltose, sacarose, galactose, lactose, trealose, melibiose, L-arabinose, celobiose, xilose, rafinose, dulcitol, ramnose, inulina, inositol) - Fontes de nitrogênio (peptona e KNO3) 3- Técnica Preparar suspensão da levedura ajustando a turbidez de acordo com o padrão 5 da escala de MacFarland. Fundir os meios C e N e estabilizá-los em banho Maria a 50F 0B 0C durante a realização da prova. Para verificar a assimilação de fontes de carbono, misturar 2 mL da suspensão com 40 mL do meio C e verter em placa de Petri de 150 x 15 mm. Para observar a assimilação de fontes de nitrogênio, misturar 1 ml da suspensão com 20 ml do meio N, e verter em placa de Petri de 90 x 15 mm. Após a solidificação dos meios, distribuir equidistantemente as fontes de carbono (meio C) ou nitrogênio (meio N) sobre o ágar. Incubar a 30F 0B 0C durante 24-48 horas. Realizar leitura e observar surgimento de halo de crescimento na área correspondente a cada fonte. PAGE 19 VI - Produção de Urease 1- Princípio É prova complementar de grande utilidade para confirmar a identificação de algumas leveduras. Por exemplo, Cryptococcus spp., Trichosporon spp. e Rhodotorula spp. O dermatófito T. mentagrophytes são urease positivos. 2- Material -Cultivo de 24-48 horas -Meio de uréia de Christensen 3- Técnica Semear cultivos de 24-48 horas na superfície do meio de uréia de Christensen. Incubar à temperatura de 30F 0B 0C durante 24-48 horas e observar a viragem do indicador. 4- Leitura Vermelho = positivo Amarelo = negativo II - Produção de Cápsula 1- Princípio A formação de cápsula é observada em espécies de Cryptococcus, embora possa ocorrer em outras espécies de leveduras. A observação de cápsula no exame direto de uma levedura necessita complementação posterior da identificação através de outras técnicas (prova da urease, cultivo em meio niger, auxanograma, etc.). 2- Material -Cultivo da levedura-problema -Lâmina PAGE 19 -Lamínula -Água destilada esterilizada -Tinta da China 3- Técnica Após homogeneizar a levedura com uma gota de água destilada e uma gota de tinta da China sobre uma lâmina, sobrepor uma lamínula e observar ao microscópio. 4- Leitura As preparações positivas irão mostrar a presença de uma área clara, a cápsula, em torno da célula leveduriforme, sobre um fundo negro. VIII - Produção de pigmento no ágar-niger 1- Princípio Quando Cryptococcus neoformans é semeado num meio contendo extrato de semente de niger, girassol ou alpiste, as colônias tornam-se negras ou marrons devido a atividade de fenol oxidase da levedura. Colônias de outras leveduras, incluindo outras espécies de Cryptococcus irão manter sua cor original. Esse meio deve ser utilizado na triagem para isolamento de C. neoformans. 2- Material -Meio de ágar-niger -Alça de platina -Cultivo da levedura-problema 3- Técnica Semear a levedura-problema em placa contendo meio de ágar-niger, pelo método do esgotamento. Observar o crescimento da levedura na placa incubada a 37oC. 4- Leitura PAGE 19 A colônia de C. neoformans apresenta coloração marrom ou negra. IX - Produção de ascosporos (Eugenio Reyes Arenas) 1- Princípio Algumas espécies de leveduras formam ascos, que alojam esporos sexuados, as ascosporas. A observação dessas estruturas é importante para a identificação da levedura. Para estimular a produção de ascosporas é necessário cultivar o isolado em meios especiais 2- Material -Cultivo da levedura-problema -Placa contendo meio de Gesso, ou V-8. -Alça de platina -Bateria de Ziehl Nielsen -Lâmina 3- Técnica Semear a levedura-problema em meio de apropriado e incubar a 37F 0B 0C ou à temperatura ambiente, de acordo com a exigência do isolado. Após 5-7 dias, realizar esfregaço em lâmina, corar pela técnica de Ziehl Nielsen e observar ao microscópio com objetiva de 100 x. 4- Leitura Examinar a forma e tamanho dos ascos e ascosporas e o número de ascosporas em cada asco. Principais estruturas microscópicas dos fungos Hifa: Estruturas tubulares, constituídas de talo filamentoso (Segundo a cor, podem ser classificadas como hialina ou demácea) PAGE 19 Reprodução assexuada interna Reprodução sexuada interna 2.- Observe e desenhe as seguintes estruturas microscópicas dos seguintes fungos filamentosos: Trichophyton rubrum T. mentagrophytes T. tonsurans Microsporum gypseum Microsporum canis Epidermophyton floccosum Aspergillus spp Penicillium spp Paecilomyces spp PAGE 19 Fusarium spp Rhizopus spp Mucor spp Phialophora spp Cladosporium spp Fonsecaea pedrosoi Alternaria spp Curvularia spp Nattrassia mangiferae PAGE 19 Sporothrix schenkiiHistoplasma capsulatum Paracoccidioides brasiliensis 25F 0B 0 25 F 0 B 0 25 F 0 B 0 37F 0B 0 37 F 0 B 0 37 F 0 B 0 PAGE 19