RELATÓRIO DE FARMACOLOGIA: DETERMINAÇÃO DA DOSE LETAL em Mus musculus

RELATÓRIO DE FARMACOLOGIA: DETERMINAÇÃO DA DOSE LETAL em Mus musculus

DETERMINAÇÃO DA DOSE LETAL em Mus musculus ALEXANDRE XAVIER DE L. DA SILVA

TERESINA-PI, ABRIL DE 2010

O estudo da relação dose-resposta ou dose-efeito é extremamente importante para os toxicologistas. Existe uma relação de dose-resposta gradativa em determinado individuo e uma relação de dose resposta quântica para a população. As doses gradativas de um fármaco administrado a determinado indivíduo geralmente levam ao aumento da magnitude da resposta à medida que a dose aumenta. Numa relação de dose-resposta quântica, a percentagem da população afetada cresce à medida que a dose aumenta, sendo uma relação quântica porque o efeito é especificado como presente ou ausente em determinado indivíduo. Esse fenômeno de doseresposta quântica é de extrema importância em Toxicologia e usado para determinar a dose letal média (DL50) dos fármacos e outros compostos químicos. (GILMAN, 2007).

O objetivo desta prática foi o estudo da toxicidade de uma droga

(Tionembutal sódico) e o estabelecimento da correlação dose-efeito de uma droga em grupo de animais da espécie Mus musculus.

Foram utilizados quinze camundongos da espécie Mus musculus para 4 bancadas de grupos num total de 60 animais distribuídos em três lotes de cinco. Cada grupo de animal recebeu uma dose diferente de Tionembutal sódico por via intraperitoneal com concentração e dosagem de cada aplicação variando de acordo com o lote de animais utilizado: o primeiro grupo recebeu uma dose de 50mg/kg da droga, na concentração de 5mg/ml ; o segundo grupo recebeu uma dose de 100mg/kg, na concentração de 10mg/ml; e o terceiro lote recebeu uma dose de 200mg/ml, na concentração de 20mg/ml. Os animais foram pesados na balança, para o cálculo das doses a serem administradas.

Anotou-se o tempo de cada injeção e após 20 min. de administração, observou-se o comportamento dos animais, no sentido de anestesia ou morte. Por último, anotaram-se os dados obtidos sobre a porcentagem de animais anestesiados e mortos para cada dose administrada e traçou-se um gráfico mostrando nas abcissas os valores das doses e nas ordenadas a porcentagem dos efeitos (anestesiado-morto).

GRÁFICO 01: CURVA DOSE-RESPOSTA INDIVIDUAL RELACIONANDO A PERCENTAGEM DOS INDIVÍDUOS QUE RESPONDERAM AO EFEITO E DOSE DA DROGA UTILIZADA, SOBRE O Mus musculus. TERESINA, 2010

FONTE: LABORATÓRIO DE FARMACOLOGIA DA UFPI, ALUNOS DE FARMÁCIA -2010.1

*Dos 5 ratos que receberam dose de 50 ml, nenhum morreu, ou seja 0%. Dos 5 que receberam dose de 100 ml, nenhum morreu. Dos 5 que receberam dose de 200 ml, 4 morreram, ou seja, 80% da população.

DL (DOSE LETAL) = 160 ml
DE(DOSE EFETIVA) = 25 ml
IT = 160/256,4
FONTE: LABORATÓRIO DE FARMACOLOGIA, UFPI. ALUNOS DE FARMÁCIA, 2010.1

CÁLCULO 01: ÍNDICE TERAPÊUTICO. TERESINA, 2010 IT(ÍNDICE TERAPÊUTICO) = DL50/DE50

Anestesiados mortos

Dose Eficaz Dose Letal

GRÁFICO 02: CURVA DOSE-RESPOSTA COLETIVA RELACIONANDO A PERCENTAGEM DOS INDIVÍDUOS QUE RESPONDERAM AO EFEITO E DOSE DA DROGA UTILIZADA, SOBRE O Mus musculus. TERESINA, 2010

FONTE: LABORATÓRIO DE FARMACOLOGIA DA UFPI, ALUNOS DE FARMÁCIA -2010.1

*Dos 60 ratos das 4 bancadas (Divididos em 3 grupos de 20 ratos para cada dose), todos foram anestesiados em todas as doses e 2 ratos dos 20 que receberam a dose de 50 ml morreram, ou seja, 10%. Dos 20 que receberam dose de 100 ml, também 2 morreram(10%). Dos 20 que receberam dose de 200 ml, 14 morreram, ou seja, 70% da população.

DL (DOSE LETAL) = 155 ml
DE(DOSE EFETIVA) = 24 ml
IT = 155/246,45
FONTE: LABORATÓRIO DE FARMACOLOGIA, UFPI. ALUNOS DE FARMÁCIA, 2010.1

CÁLCULO 02: ÍNDICE TERAPÊUTICO. TERESINA, 2010 IT(ÍNDICE TERAPÊUTICO) = DL50/DE50

Anestesiados Mortos

A avaliação da toxicidade é realizada com o objetivo de determinar o potencial de novas substâncias e produtos causar danos à saúde humana. Testes que avaliam a toxicidade sistêmica aguda são utilizados para classificar e apropriadamente rotular substancias de acordo com o seu potencial de letalidade ou toxicidade como estabelecido pela legislação. Além da letalidade, outros parâmetros são investigados em estudos de toxicidade aguda sistêmica para identificar o potencial tóxico em órgãos específicos, identificar a toxicocinética e a relação-dose resposta. Outras informações podem ainda ser obtidas numa avaliação de toxicidade aguda como: indicativos sobre o mecanismo de ação tóxica; diagnóstico e tratamento das reações tóxicas; estabelecimento das doses para estudos adicionais de toxicidade; informações para a comparação de toxicidade entre substâncias de mesma classe; informações sobre quais seriam as conseqüências de exposições acidentais no trabalho ou no ambiente doméstico; além de ser um padrão para a avaliação de testes alternativos ao uso de animais experimentais (VALADARES, 2006).

O teste da DL50 foi inicialmente introduzido em 1927 por Trevan para avaliar substâncias que seriam utilizadas por seres humanos como a digitallis e a insulina. Entretanto, na década de setenta, este teste, o qual tinha como objetivo encontrar uma única dose letal de uma substância para metade dos animais do grupo teste começou a ser empregado amplamente como base de comparação e classificação da toxicidade de substâncias. Este teste tornou-se gradativamente um teste pré-requisito para várias agências reguladoras, como a americana Food and Drugs Administration (FDA), responsáveis pela a aprovação de novos fármacos, aditivos alimentares, ingredientes cosméticos, produtos domésticos, químicos industriais e pesticidas. Para a realização do teste da DL50 eram empregados mais de 100 animais para cada espécie estudada (normalmente ratos e camundongos) e para cada substância testada (VALADARES, 2006).

“Quando se trabalha com animais com animais de laboratório, um dos efeitos tóxicos mais convenientes para se monitorar é a letalidade. A morte é universal; todas as drogas são capazes de causá-la; por conseguinte, representa um ponto final definido que pode ser reconhecido rapidamente e de modo inequívoco. A dose que causa a morte em 50% dos animais testados em determinado período de tempo é designada dose letal mediana (DL50). A relação entre esta dose e a dose efetiva mediana (DL50/DE50) define o índice terapêutico (IT), medida grosseira, porém útil da segurança de uma droga.

Índice terapêutico é uma medida utilizada em Farmacologia, que relaciona a dose da droga necessária para produzir um efeito desejado com a que produz um efeito indesejado. Medicamentos de índice terapêutico estreito apresentam o valor da dose tóxica mediana (TD50) bastante próxima do valor da dose eficaz mediana (ED50)” (GILMAN, 2007). “Se todos os outros aspectos forem iguais, uma droga com grande índice terapêutico será considerada mais segura do que um agente com índice menor. Na verdade, quando numerosos congêneres estão sendo testados concomitantemente, os com índices terapêuticos mais favoráveis passam a ter preferência em investigações posteriores, sendo considerados os candidatos mais promissores para aplicação clínica. Infelizmente a relação DL50/DE50 não prevê totalmente a segurança relativa. As drogas produzem muitos efeitos tóxicos além da morte, impedindo o seu uso em seres humanos. Um fármaco com grande índice terapêutico em relação a determinada reação adversa pode não ser adequado devido a outro tipo de toxicidade. Uma segunda limitação do índice terapêutico é que a variabilidade biológica não é considerada. O objetivo da farmacoterapia é obter um efeito desejado em praticamente todos os pacientes, sem produzir qualquer toxicidade” (WANNMACHER, 2007).

Para avaliar completamente a segurança de uma droga em animais, devem-se efetuar testes de toxicidade aguda, subaguda e crônica em várias espécies diferentes e por várias vias diferentes de administração. São efetuados estudos especiais para detectar a atividade carcinogênica e teratogênica, sendo utilizados adjuvantes para testar novos produtos quanto à sua tendência a causar dermatite de contato. Além das avaliações de toxicidade, são efetuadas investigações farmacocinéticas para determinar a velocidade e a extensão de absorção da droga, seu padrão de distribuição, meia-vida plasmática e vias de eliminação (WANNMACHER, 2007).

Segundo OGA, 1996, a curva dose-resposta representa a relação entre a dose e a proporção da população que responde com um efeito quântico. Em geral estas curvas são sigmóides. Uma forma de explicar a configuração das curvas dose-resposta é dizer que cada indivíduo de uma população tem uma “tolerância” própria e requer certa dose antes de responder com um efeito. A princípio, existem tanto uma dose baixa a qual ninguém responderá como uma dose alta a qual todos responderão. A razão deve-se à variabilidade biológica, isto é, à diferente sensibilidade dos indivíduos (ou animais) à ação de determinada substância química. A concentração terapêutica situa-se entre as concentrações geradoras de efeito mínimo eficaz (limite mínimo) e efeito tóxico (concentração máxima tolerada, limite máximo). A curva sigmóide ou em forma de S é uma expressão curvilínea comumente observada na maior parte das curvas dose-resposta (GRÁFICOS 01 E 02). O fundamento biológico desta relação se pode compreender parcialmente quando se pensa na natureza da distribuição de frequência das suscetibilidades ou resistências individuais em uma população. No entanto, a equação matemática correspondente à curva sigmóide é difícil de manusear e, por isso é levada a se transformar em uma linha reta para apresentação e avaliação dos dados.

Medicamentos com amplo IT apresentam uma ampla faixa de concentração que leva ao efeito requerido, pois, as concentrações potencialmente tóxicas excedem nitidamente as terapêuticas, esta faixa de concentração é denominada "janela terapêutica”. Infelizmente, muitos fármacos apresentam uma estreita janela terapêutica (IT<10), por apresentarem uma pequena diferença entre as concentrações terapêuticas e tóxicas (CÁLCULO 01) Nestes casos, há a necessidade de cuidadosa monitorização da dose, dos efeitos clínicos e mesmo das concentrações sangüíneas destes fármacos, visando assegurar eficácia sem toxicidade.

A droga utilizada (Tionembutal) apresentou um baixo índice terapêutico (CÁLCULO 01 e 02), já que em concentrações absolutas valores abaixo de 10 são considerados ruins, portanto apresenta uma margem de segurança restrita para utilização clínica.

Através do experimento, pode-se observar a ação letal de um fármaco quando administrado em quantidades acima das doses terapêuticas. Também notou-se que o cálculo do índice terapêutico é de extrema importância para a formulação de uma nova droga e também com base nas DL50 de várias substâncias, são estabelecidas classes toxicológicas de produtos químicos e farmacológicos.

GILMAN, A. G. As Bases Farmacológicas da Terapêutica. 11a ed. Rio de Janeiro: Mcgraw-Hill Interamericana, 2007.

OGA, S. (Ed.) - Fundamentos de Toxicologia. Atheneu:São Paulo, 1996

WANNMACHER, L.FERREIRA, M.B.C. Farmacologia clínica para dentistas. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007

VALADARES, M. C. Avaliação de toxicidade aguda: estratégias após a “era do teste DL50 “Revista Eletrônica de Farmácia Vol 3(2),93-98,2006, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Goiás-GO

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