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Análise Cromossômica da Síndrome do X Frágil

A síndrome do X frágil (SXF) é uma doença de curso crônico com perda progressiva das habilidades intelectuais, especialmente após a puberdade (Curfs et al. 1997). A SXF é geneticamente transmitida, de caráter dominante e ligada ao cromossomo X (McKusick et al. 1990). Sua maior conseqüência é o prejuízo intelectual de grau leve a moderado. A SXF é a causa mais comum de retardo mental herdado em humanos (Nussbaum & Ledbetter, 1989). 90% dos casos de deficiência mental têm um componente genético associado e fatores genéticos isoladamente são a causa mais comum de retardo mental. A síndrome está associada com um sítio cromossômico frágil designado FRAXA (sítio Frágil, cromossomo X, sítio A), localizado na posição Xq27.3, próximo ao final do braço longo do cromossomo X.

A mutação responsável pela síndrome foi descoberta em 1991, consistindo ela de uma repetição anormal da seqüência de trinucleotídeos CGG dentro do gene FMR1 (do inglês - Fragile X Mental Retardation Gene 1) (Verkerk et al. 1991). Num indivíduo normal o gene FMR1 consiste, em média, de 38 quilobases (kb) (Eichler et al. 1993), e a seqüência de trinucleotídeos CGG varia de 6 a 52 repetições (Fu et al. 1991). Este gene é capaz de transcrever um RNAm, e este codifica a proteína FMRP (Siomi et al. 1993).

Naqueles afetados pela síndrome, o número de repetições da seqüência CGG pode chegar até a alguns milhares. Esta expansão desliga o gene FMR1, e conseqüentemente, a proteína FMRP não é produzida (Stutcliffe et al. 1992). A ausência desta, provavelmente, é a responsável pelas características fenotípicas da doença Sujeitos normais apresentam de 2 a 50 cópias do trinucleotídeo CGG, as pré-mutações, presentes em homens normais e mulheres portadoras variam de 50 a 200 cópias e indivíduos afetados tem mais de duzentas cópias (Rousseau et al. 1991).

Aproximadamente 80% dos homens portadores da mutação completa terão algum grau de retardo mental, enquanto, apenas 30% das mulheres com este tipo de mutação terão este mesmo grau de retardo (Sherman 1985). O homem portador de uma pré-mutação é chamado de "transmissor masculino". Este transmissor masculino passará a pré-mutação para todas as suas filhas. A filha com a pré-mutação terá um fenótipo normal, todavia, o seu gene FMR1 poderá sofrer uma expansão que a porá em risco de ter filhos com a mutação completa e o fenótipo da doença (American Academy of Pediatrics 1996). O mecanismo molecular específico que resulta na expansão da repetição de trinucleotídeos responsável pela anomalia

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Análise Cromossômica da Síndrome do X Frágil do X Frágil continua ainda não estabelecida. A hipótese mais provável é que ocorra um erro na replicação do DNA. Dentro do sítio normal de repetições CGG no gene FMR1 usualmente existem uma ou mais seqüências AGG. Aparentemente essas estabilizam e impedem erros durante a replicação.

As repetições AGG intercaladas na região CGG e o número de repetições CGG parecem ser os determinantes principais da estabilidade dos alelos. Diferentes estudos tem demonstrado que a maior variabilidade de repetições acontece no terminal 3'(Eichler et al. 1994; Zhong et al. 1995). Desse modo a instabilidade é polarizada e fica na região terminal 3'. Isto apóia a hipótese de que a perda da seqüência AGG no terminal 3' possa agir desestabilizando a região de repetição CGG levando a sua expansão para mutação completa. O entendimento dos mecanismos responsáveis pela expansão anômala das repetições CGG nos pacientes com a Síndrome do X Frágil poderá revelar alvos aonde métodos de terapia gênica possam atuar.

The syndrome of the fragile X (SXF) is an illness of chronic course with gradual loss of the intellectual abilities, especially after the puberty (Curfs et al. 1997). The SXF geneticamente is transmitted, of dominant and on character to the chromosome X (McKusick et al. 1990). Its bigger consequence is the intellectual damage of light degree the moderate one.

The SXF is the cause most common of inherited mental retardation in human beings

(Nussbaum & Ledbetter, 1989). 90% of the cases of mental deficiency have a genetic component associate and genetic factors separately are the cause most common of mental retardation. The syndrome is associated with a fragile chromosomic small farm assigned FRAXA (Fragile small farm, chromosome X, small farm), located in the Xq27.3 position, next to the end to the long arm of chromosome X. The responsible mutation for the syndrome was discovered in 1991, consisting it of an abnormal repetition of the sequence of trinucleotídeos CGG inside of gene FMR1 (of the English - Fragile X Mental Retardation Gene 1) (Verkerk et al. 1991). Of a normal individual gene FMR1 consists, on average, of 38 quilobases (kb) (Eichler et al. 1993), and the sequence of trinucleotídeos CGG varies of 6 the 52 repetitions (Fu et al. 1991). This gene is capable to transcribe a RNAm, and this codifies protein FMRP (Siomi et al. 1993).

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In those affected by the syndrome, the number of repetitions of sequence CGG can arrive until the some thousand. This expansion disconnect gene FMR1, and consequently, protein FMRP is not produced (Stutcliffe et al. 1992). The absence of this, probably, is responsible for the fenotípicas characteristics of the illness the normal Citizens presents of 2 the 50 copies of trinucleotídeo CGG, the daily pay-mutations, gifts in normal men and carrying women vary of 50 the 200 copies and affected individuals have two hundred copies more than (Rousseau et al. 1991). Approximately 80% of the carrying men of the complete mutation will have some degree of mental retardation, while, only 30% of the women with this type of mutation will have this exactly retardation degree (Sherman 1985).

The carrying man of a daily pay-mutation is called “masculine transmitter”. This masculine transmitter will pass the daily pay-mutation for all its children. The son with the daily pay-mutation will have one fenótipo normal, however, its gene FMR1 will be able to suffer an expansion that will at risk put it to have children with the complete mutation and fenótipo of the illness (American Academy of Pediatrics 1996). The specific molecular mechanism that results in the expansion of the responsible repetition of trinucleotídeos for the anomaly of the Fragile X continues established not yet. The most likely hypothesis is that an error in the response of the DNA occurs. Inside of the normal small farm of repetitions CGG in gene FMR1 usually they exist one or more sequences AGG. Pparently these stabilize and hinder errors during the response.

Repetitions AGG intercalated in region CGG and the number of repetitions CGG seem to be determinative the main ones of the stability of the alelos. Different studies have demonstrated that the biggest variability of repetitions happens in the terminal 3 ' (Eichler et al. 1994; Zhong et al. 1995). In this manner the instability is polarized and is in terminal region 3 '. This apóia the hypothesis of that the loss of sequence AGG in terminal 3 ' can act desestabilizando the region of repetition CGG leading its expansion for complete mutation.

The agreement of the responsible mechanisms for the anomalous expansion of repetitions CGG in the patients with the Syndrome of the Fragile X will be able to disclose to targets where methods of gênica therapy can act.

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2. HISTÓRICO

Um achado, que já no século XIX chamava a atenção dos pesquisadores, era o excesso de homens com retardo mental entre os indivíduos internados em instituições para retardados mentais, em relação às mulheres. Penrose, em 1938, estimou esse excesso como sendo de 25%, que hoje se sabe ser devido, ao menos em parte, ao grande número de doenças associadas a retardo mental que são determinadas por genes situados no cromossomo X.

Martin e Bell, em 1943, publicaram, pela primeira vez, o relato de uma família com vários indivíduos afetados por um retardo mental inespecífico, cujo heredograma era sugestivo de herança ligada ao cromossomo X.

Anos mais tarde, em 1969, Lubs publicou o achado de uma família com retardo mental ligado ao cromossomo X, na qual observou a manifestação de um cromossomo X marcador, com satélites na região distal de seu braço longo, em vários indivíduos afetados do sexo masculino e em algumas mulheres portadoras.

Finalmente, em 1978, Turner e col., realizando um estudo citogenético em várias famílias que apresentavam retardo mental ligado ao cromossomo X e casos com macroorquidia, puderam chegar à conclusão de que a presença do RM-X, associado ao cromossomo X marcador e a macroorquidia constituiam uma mesma entidade genética, que passou a receber várias denominações como Síndrome de Martin-Bell, Síndrome de Escalante, Síndrome de macroorquidia e cromossomo X marcador, hoje denominada Síndrome do Cromossomo X Frágil.

A síndrome do cromossomo X frágil é a mais freqüente dessas doenças de herança ligada ao X e afeta cerca de 5% dos retardados mentais. É, assim, a segunda causa genética de retardo mental, só suplantada em freqüência pela síndrome de Down. Entretanto, ao contrário da síndrome de Down que não tende a repetir nas famílias, a síndrome do cromossomo X frágil tem risco alto de recorrência na irmandade dos afetados.

3. ESTUDO CROMOSSÔMICO

O gene causador da síndrome foi chamado de FMR1 (Fra X Mental Retardation 1).

Esse gene apresenta 38kb de comprimento, 17 exons, mostrou-se conservado do ponto de vista evolutivo, desde os invertebrados, e é responsável pela transcrição de um RNAm de

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4,8kb, cujo produto proteico foi detectado em todos os tipos de células analisados, especialmente no cérebro e gônadas. A proteina FMRP é um tipo de proteina capaz, após ser traduzida, de migrar novamente para o núcleo, e do núcleo para o citoplasma. Se associa aos polirribossomos e auxilia na tradução de RNAs mensageiros em proteinas, sendo que a tradução fica prejudicada na ausência dessa proteina ou quando presente mas de forma alterada (Feng e col, 1997). É produzida próximo a sinapses, em resposta a ativação de um neurotransmissor, tendo aparentemente um papel importante no desenvolvimento de conexões sinápticas, o que explica sua relação com retardo mental.

O que chamou a atenção na caracterização molecular do gene FMR1 foi a presença, na sua porção 5’, transcrita mas não traduzida, de uma repetição de trinucleotídeos CGG, sendo que o número de cópias da trinca se mostrou variável. Nos indivíduos normais da população, costumam ser encontradas de 6 a 52 repetições CGG. Nos indivíduos afetados, portadores do que se considera como mutação completa, apresentam um número superior a 200 repetições CGG, podendo chegar a milhares. Nesses indivíduos pode ocorrer uma instabilidade a nível somático, caracterizada por um mosaico de fragmentos de tamanhos diversos. Indivíduos com um número intermediário, de 52 a cerca de 200 repetições CGG, são quase sempre fenotipicamente normais, apesar do aumento do número de cópias. São portadores do que é considerada uma pré-mutação.

A designação da síndrome decorre do fato de o cromossomo X dos afetados apresentar uma falha na porção subterminal de seu braço longo (Xq27.3), quando suas células são cultivadas em condições de deficiência de ácido fólico ou que afetem o metabolismo das bases nitrogenadas necessárias para a síntese do DNA. Esse cromossomo é denominado de X frágil - fra(X) - e sua detecção no exame dos cromossomos mostra que o indivíduo com retardo mental tem a síndrome do cromossomo X frágil. Nem todas as células do afetado, entretanto, mostram o fra(X), o que exige a análise de pelo menos 100 metáfases, após cultivo dos linfócitos em condições que induzam o aparecimento da falha, para que se possa afastar ou estabelecer o diagnóstico com segurança.

A síndrome afeta tanto homens como mulheres, mas nestas o quadro clínico é em geral menos grave. A penetrância do gene é incompleta, pois entre os homens portadores do gene cerca de 20% não manifestam qualquer sinal clínico, o que ocorre também com cerca de 65% das portadoras. Esses portadores assintomáticos do gene não manifestam o fra(X) e, assim, não podem ser diagnosticados através do exame dos cromossomos.

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A síndrome do cromossomo X frágil tem peculiaridades de herança que atraíram a atenção dos geneticistas desde a descrição das primeiras genealogias com afetados. Na prole das mulheres portadoras do gene, mas fenotipicamente normais, em média 29% das crianças (20% dos meninos e 9% das meninas) eram afetadas. Se uma portadora era afetada o risco para sua prole era maior, de cerca de 40%. Já as filhas dos homens portadores normais, todas elas certamente portadoras, nunca eram afetadas. Observou-se ainda que o risco para a prole de mulheres portadoras fenotipicamente normais aumentava nas genealogias com o passar das gerações. Assim, em média, as avós normais dos afetados, que eram portadoras do gene, tinham risco menor de ter crianças afetadas do que as mães dos afetados. Este fenômeno ficou conhecido como "paradoxo de Sherman", em referência à pesquisadora que primeiro o descreveu.

O estudo da transmissão do gene alterado mostrou que os homens com a pré-mutação a transmitem para suas filhas com o número de repetições praticamente inalterado. Mas quando transmitida por uma mulher, a pré-mutação pode sofrer aumento no número de repetições de trinucleotídeos, ficando ainda na categoria de pré-mutação ou transformando-se numa mutação completa. As mulheres com pré-mutações com maior número de repetições são aquelas com maior risco de ter criança afetada.

Não se tem ainda uma explicação biológica para esse comportamento dessa alteração do DNA, mas essas observações explicam as peculiaridades de herança da síndrome. As mulheres normais portadoras têm maior risco de ter crianças afetadas que os homens normais portadores, porque somente quando elas transmitem a pré-mutação ela tem possibilidade de expandir-se. Também, analisando-se as genealogias, pode-se observar que as pré-mutações são menores nas gerações mais antigas, expandindo-se ao serem transmitidas pelas mulheres, de maneira que as mulheres nas gerações mais recentes têm risco maior de prole afetada. Se uma mulher é afetada, ela já é portadora da mutação completa e seus filhos que recebem essa mutação são todos afetados. Quando é uma filha dessa mulher que recebe essa mutação completa, a probabilidade de ser afetada é de 50%, provavelmente um efeito da inativação do cromossomo X.

Os estudos sobre a transcrição do FMR1 mostraram que os indivíduos com o gene normal e aqueles com a pré-mutação produzem igualmente o mRNA. Já nos indivíduos afetados o mRNA não é detectado, mostrando que o gene está silencioso. Este silêncio do

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Análise Cromossômica da Síndrome do X Frágil gene está associado à metilação de uma seqüência de dinucleotídeos CG (uma ilha CpG) que ocorre no início do gene. Essas seqüências estão presentes no início de vários genes e se mantêm desmetiladas quando o gene está ativo. Nos genes que não estão ativos no cromossomo X inativo das mulheres essas seqüências estão metiladas. Nos genes do cromossomo X dos homens, que está sempre ativo, essas regiões estão desmetiladas. Mas no caso da mutação completa do gene FMR1, a ilha CpG está sempre metilada mesmo no cromossomo X ativo.

A clonagem do FMR1 e a descoberta da alteração que causa a síndrome do cromossomo X frágil tornaram possível a identificação dos indivíduos fenotipicamente normais que são portadores da pré-mutação, através da análise do DNA .Também permite o diagnóstico de fetos portadores da mutação completa no primeiro trimestre de gestação, através do estudo do DNA das células das vilosidades coriônicas.

O FMR1 é um gene evolutivamente conservado desde os invertebrados e deve ter, portanto, um papel importante nos organismos. No homem, o produto protéico já foi detectado em todos os tipos de células analisados, especialmente no cérebro e nas gônadas. Desconhece-se, entretanto, a função dessa proteína e conseqüentemente por que sua ausência leva ao quadro clínico da síndrome do cromossomo X frágil.

Há basicamente dois tipos de testes laboratoriais que permitem o diagnóstico da síndrome do X-frágil: testes cromossômicos e testes moleculares. O valor relativo destes testes depende da situação específica. Por exemplo, para uma criança do sexo masculino com retardo mental e pouco ou nenhum dismorfismo, está indicado o estudo cromossômico completo com pesquisa específica adicional de X-frágil. A grande vantagem deste teste é que ele também permite o diagnóstico de outras alterações cromossômicas que podem ser a verdadeira causa do retardo mental. A desvantagem é de que ele é relativamente dispendioso e apresenta uma percentagem pequena, mas significativa, de resultados falso-positivos e falsonegativos para a síndrome do X-frágil. Por outro lado, para uma menina com retardo mental é recomendável fazer diretamente o teste molecular baseado no uso de sondas de DNA (método de Southern), já que neste caso o estudo cromossômico para pesquisa de X-frágil tem frequência altíssima de resultados falso negativos.

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4.SINAIS CLINICOS

Clinicamente, além do retardo mental nos meninos, a síndrome está associada a um dismorfismo facial discreto, aumento do tamanho das orelhas e desenvolvimento pós-puberal de macroorquidismo. Não há dismorfismos nas mulheres afetadas. A grande importância do reconhecimento clínico e diagnóstico específico da síndrome do X-frágil vem do fato de que virtualmente todos os casos são hereditários e familiais. O diagnóstico de uma criança com a síndrome do X-frágil estabelece uma oportunidade valiosa de fazer estudos na família, para identificar outros afetados e portadoras, e de fazer um aconselhamento genético eficiente levando à prevenção de novos casos. Infelizmente, o diagnóstico clínico da síndrome do X- frágil na infância é difícil por causa da inespecificidade dos sinais clínicos.

O comprometimento mental dos afetados pela síndrome do cromossomo X frágil é variável, podendo ir desde uma dificuldade de aprendizado a um retardo profundo. Entre os homens, o retardo mental grave é, entretanto, o mais freqüente, ocorrendo em 42% dos pacientes. Já nas mulheres afetadas predominam o retardo do tipo leve ou a inteligência limítrofe.

O comportamento dos meninos afetados tem características muitas vezes mais úteis para o diagnóstico do que os sinais físicos. A primeira queixa que leva o paciente ao consultório é geralmente o atraso na aquisição da fala, associado a uma hiperatividade importante. A fala continua sempre comprometida, pois é repetitiva, com alterações de ritmo e fluência, observando-se também problemas de articulação. Algumas características do autismo são também freqüentes: o contato pelo olhar e pelo tato é evitado, ocorrem movimentos estereotipados das mãos e mordidas no dorso das mãos que chegam a provocar calosidades. Não há na verdade um desinteresse em interagir socialmente, mas se observa um comportamento de aproximação e retirada, que se evidencia pelo desviar do olhar e do próprio corpo, enquanto cumprimenta as pessoas ou conversa com elas. É interessante que vários estudos citogenéticos e moleculares têm mostrado que aproximadamente 7% dos pacientes do sexo masculino diagnosticados como autistas têm na verdade a síndrome do cromossomo X frágil. Entre as mulheres afetadas, estas características são menos marcantes, mas nelas não são raras a timidez e a ansiedade no contato social. Alguns estudos feitos em meninas diagnosticadas como autistas mostraram que 4% delas têm a síndrome do cromossomo X frágil.

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O aumento do volume testicular (macrorquidia) é uma característica muito freqüente entre os afetados adultos, estando presente em cerca de 80% dos casos. Entretanto somente 20% dos pré-púberes têm macrorquidia, o que a torna uma característica de baixo valor diagnóstico em crianças. Além disso, pacientes com outros tipos de retardo mental também podem apresentar macrorquidia.

5. DIAGNÓSTICO

O diagnóstico tornou-se mais preciso a partir de 1991, quando o gene FMR1 foi descoberto. Com base em estudo molecular (DNA), identifica-se o número de cópias CGG deste gene. Esse teste pode ser prescrito por qualquer médico. É realizado através de uma amostra de sangue encaminhada para análise em laboratórios de genética, especializados em diagnóstico molecular.

O exame pré-natal também é possível, sendo recomendado quando existe diagnóstico confirmado na família e sabe-se que a gestante é portadora da pré-mutação.

Pelo fato dos sintomas da SXF serem bastante sutis, especialmente em crianças pequenas - e devido à sua alta freqüência entre a população - profissionais especializados recomendam a prova do X-Frágil para avaliar ou reavaliar casos de atraso de desenvolvimento e retardo mental de origem desconhecida.

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