Relatório Cinética Enzimática

Relatório Cinética Enzimática

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

COLEGIADO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DEISE ALESSANDRA

JANILDA MOREIRA

LARISSA RAMALHO

THÁLITA CAIRES.

RELATÓRIO DE BIOQUÍMICA

CINÉTICA ENZIMÁTICA

FEIRA DE SANTANA

2010

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

COLEGIADO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DEISE ALESSANDRA

JANILDA MOREIRA

LARISSA RAMALHO

THÁLITA CAIRES.

Relatório solicitado com objetivo de relatar os procedimentos e resultados da aula prática sobre cinética enzimática. Solicitado pelo professor Bruno, como avaliação processual da I Unidade da disciplina de Bioquímica durante o semestre 2010.1

FEIRA DE SANTANA

2010

Cinética Enzimática

1. Objetivo

Comparar a atividade enzimática em relação à temperatura, pH e concentração

2. Fundamentação Teórica

Enzimas são proteínas que catalisam uma reação química específica e em sua maioria são conjugadas, estando associadas a grupos não-protéicos. Sua atividade catalítica depende da conservação da sua estrutura original e qualquer variação nessa estrutura altera significativamente sua atividade.

Uma característica comum de todas as enzimas é a presença e uma fenda em sua estrutura, formada principalmente por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos dentro dos quais se fixam o substrato. Certos resíduos de aminoácidos que são responsáveis pela interação estérica com o substrato e, portanto, pela especificidade do sistema, estão localizados nesta fenda, bem como os aminoácidos envolvidos no aspecto catalítico da reação. Na maioria dos casos estes resíduos são do tipo iônico e mais reativo. Além disso, a união dos íons precedentes da solução podem também cooperar na presença do substrato na catálise da reação.

Nesta prática será verificada a cinética enzimática da amilase salivar – uma enzima capaz de hidrolisar o amido em unidades de maltose e acrodextrinas, onde a determinação da velocidade da reação está relacionada com fatores cinéticos como: temperatura, pH e concentração de substrato e da enzima, presença de cofatores e inibidores, etc.

3. Procedimentos, Resultados e Discussão

A prática foi realizada em 3 etapas nas quais foram analisados os efeitos da temperatura, pH e concentração de substrato na cinética enzimática

3.1 Efeito da Temperatura

Preparou-se uma solução de saliva 10% e desta foram adicionados 3mL em 3 tubos diferentes com identificação devida. Em outros 3 tubos também identificados preparou-se a solução de substrato contendo: 5 mL de solução de amido 2%, 1mL de NaCl 0,1M e 3,5 mL de solução tampão pH 6,5. Cada um dos tubos contendo as soluções de saliva e de substrato foram colocados em temperaturas diferentes durante 5 minutos, conforme o quadro abaixo:

Quadro 1: Tubos em temperaturas variadas

Temperaturas

Solução

0ºC

38ºC

100ºC

Saliva

Tubo 1a

Tubo 2a

Tubo 3a

Substrato

Tubo 1b

Tubo 2b

Tubo 3b

Após o tempo necessário, retirou-se 0,5 mL da solução de saliva que foram adicionados aos tubos com substrato nas temperatura correspondentes e esperou-se 2 minutos. Em seguida, dos tubos contendo a nova solução (substrato+saliva), retirou-se 2 gotas de cada tubo que foram adicionadas à outros tubos previamente preparados contendo 1mL de corante lugol. Assim, 2 gotas do tubo 1 à 0ºC foram colocadas no tubo 1 contendo lugol e desta mesma forma procedeu-se com os tubos 2 e 3 da solução de saliva+substrato. Esse instante foi considerado o tempo zero e, feito o gotejamento, os tubos principais retornaram às suas temperaturas iniciais, onde se esperou mais 2 minutos para que se iniciasse novo gotejamento em outros tubos de lugol. Na medida em que o rodízio de gotejamento intercalado em 2 minutos seguia, observava-se uma leve mudança de coloração na sequência de tubos de lugol que recebiam a solução à 38ºC. Tal observação pôde ser verificada no tubo 17 quando se atingiu o tempo de 16 minutos. A variação de cor ia de roxo escuro à azul roxeado e de azul a vinho. Essa progressão deveria seguir até se alcançar o ponto acrômico – momento em que a enzima consumiu todo o amido sendo esse ponto evidenciado pela coloração específica do lugol*. Contudo, não foi possível verificar esse ponto devido, possivelmente a não ter ocorrido uma boa homogeneização durante o preparo da solução de saliva. No entanto, sabe-se que o ponto acrômico pode ser facilmente alcançado à 38ºC, pois esta temperatura está entre a temperatura ótima de atividade, que é a mais adequada para determinada reação enzimática. Por isso, a maioria dos ensaios se fazem a 37ºC, pois se dá por

* É importante ressaltar que o lugol cora especificamente o amido, logo, quando o amido era totalmente consumido pela enzima não se observava mais a mudança de cor no tubo de lugol, uma vez que não havia mais amido para ser corado

definido que a temperatura do corpo humano é ótima para qualquer reação enzimática (HOLME, 1987).

Houve pouca mudança de coloração nos tubos de lugol que recebiam a solução a 0ºC. Esse efeito deve-se à redução da atividade enzimática à temperatura muito baixas. A mudança de coloração, mesmo que pequena, indica que, apesar da temperatura ser baixa, a enzima mantêm sua atividade (muito reduzida) e, portanto, sua estrutura também é mantida.

Nos tubos de lugol onde se gotejava a solução à 100ºC não houve nenhuma mudança de cor devido ter ocorrido uma desnaturação da enzima, o que comprometeu toda a sua atividade, uma vez que o aumento da temperatura provoca a destruição da estrutura primária e secundária da enzima através da quebra das ligações entre os aminoácidos.

3.2 Efeito do pH

Foram realizados os mesmos procedimentos aplicados para a observação do efeito da temperatura, com a diferença de que se acrescentou 1mL da solução de saliva aos tubos de substrato e a variação efetuada foi a do pH, sendo que no tubo 1 continha pH 2,0; no tubo 2 pH 6,5; e no tubo 3 pH 8,0.

Os tubos de substrato e saliva foram colocados em banho-maria à temperatura de 38ºC durante 5 minutos e, após esse tempo, misturou-se 1mL da solução de saliva a cada um dos tubos com substrato, onde se esperou mais 2 minutos para que se iniciasse o rodízio de gotejamentos nos tubos de lugol, sendo o primeiro gotejamento considerado o tempo zero.

A primeira mudança de cor começou a ocorrer no tempo de 4 minutos ao se aplicar o pH 6,5 e, neste mesmo pH, o ponto acrômico foi alcançado quando se atingiu o tempo de 12 minutos. Aplicando o pH 8,0 também foi possível chegar ao ponto acrômico, contudo, num tempo mais demorado: 38 minutos. Já com o pH 2,0 não houve nenhuma alteração da coloração e, diante disso, parou-se o gotejamento da amostra nesse pH quando se atingiu o tempo de 18 minutos.

As diferenças observadas deve-se ao fato de que as enzimas, em sua maioria, possuem um pH característico no qual sua atividade é máxima. No caso da amilase, seu pH é relativamente neutro (ou levemente ácido), sendo por isso que o ponto acrômico foi alcançado num tempo menor quando se utilizou a amostra de pH 6,5. Acima ou abaixo desse pH ótimo a atividade enzimática se reduz, motivo pelo qual o ponto acrômico demorou mais de ser alcançado quando se utilizou a amostra de pH 8,0, e nenhuma atividade foi verificada com a aplicação do pH 2,0.

3.3 Efeito da concentração

Preparou-se uma solução de saliva 10% e dela foram retiradas diferentes porções que foram colocadas em tubos previamente numerados. Também foram feitas soluções de substrato semelhante às preparadas nos experimentos anteriores, com a diferença de que a quantidade de solução tampão pH 6,5 adicionada era diferente para cada tubo de substrato, bem como a quantidade de solução de saliva adicionada. As quantidades de solução de saliva e de tampão colocados na solução se substrato são mostradas a seguir:

Quadro 1: quantidade de saliva Quadro 2: quantidade de tampão

tubos

Quantidade de saliva (mL)

1

0,5

2

1,0

3

2,5

4

0,0

tubos

Quantidade de saliva (mL)

1

3,5

2

3,0

3

1,5

4

4,0

As soluções foram colocadas em banho-maria conforme realizado anteriormente (em temperatura de 38º) e, após os 5 minutos foram retidas as quantidades devidas de solução de saliva que foram adicionadas aos tubos contendo substrato devidamente identificados. Realizado esse procedimento, esperou-se 2 minutos para se iniciar o gotejamento da solução (saliva+substrato) nos tubos de lugol, considerando o primeiro cotejamento como tempo zero. O experimento seguiu-se até se alcançar o ponto acrômico, sendo obtidos os seguintes resultados a partir da coloração obtida após a mistura da solução com lugol:

Quadro 3: coloração obtida após se aplicar a amostra ao lugol

tubos

Tempo (min)

1

2

3

4

0

marrom escuro

marrom escuro

marrom averm.

a coloração não se alterou de modo que não se alcançou o ponto acrômico

2

marrom avermelhado

laranja avermelhado

PONTO ACRÔMICO

4

marrom claro

PONTO ACRÔMICO

6

laranja avermelhado

8

amarelo alaranjado

10

laranja amarelado

12

PONTO ACRÔMICO

De acordo com os resultados, pode-se observar que o tubo 1 atingiu o ponto acrômico mais lentamente pois possuía uma menor concentração de enzima. O tubo 2 alcançou o ponto acrômico em tempo intermediário em relação aos tubos 1 e 3, sendo que este último atingiu o ponto acrômico mais rapidamente, uma vez que a concentração de enzimas era mais alta, logo, a concentração de substrato era menor. Como a solução de substrato presente no tubo 4 estava isenta de enzima (já que não foi adicionada solução de saliva), não seria possível atingir o ponto acrômico pois não havia enzimas para realizar a catálise.

Observa-se então que um aumento na concentração de enzimas leva a um aumento na velocidade da reação. Contudo, o aumento nessa velocidade é gradualmente menor em concentrações cada vez maiores de substrato (ROSKOSKI, 1997, p. 54). Desta forma, essa afirmação explica os resultados obtidos já que se observa uma relação entre a concentração de substrato e a velocidade da reação enzimática. Esse tipo de relação pode ser expressa quantitativamente através da equação de Michaelis e Menten que relaciona a velocidade da reação enzimática com duas constantes cinéticas:

  • Velocidade máxima (Vmax) – que indica que a velocidade se aproxima como um valor limite de acordo com o aumento da concentração;

  • Constante de Michaelis-Menten (Km) – que é a concentração de substrato para a metade da velocidade máxima.

Assim, a equação de Michaelis-Mentem é expressa da seguinte forma:

V = _Vmax [S]_

Km + [S]

Essa equação é muito importante, uma vez que constitui um instrumento para que se possa compreender as reações enzimáticas.

4. Conclusão

Nota-se uma eficiência catalítica admirável das enzimas devido ao seu alto grau de especificidade por seus substratos, acelerando reações químicas específicas. Observa-se que tais reações ocorrem em condições necessárias para que ocorra uma boa atividade da enzima, já que elas funcionam em condições suaves de temperatura e pH. Pôde-se verificar também que a velocidade da reação enzimática está relacionada com a concentração do substrato e que através da equação de Michaelis-Menten é possível descrever o comportamento cinético de grande maioria das enzimas.

Vale ressaltar que o bom conhecimento da estrutura das enzimas e suas condições de funcionamento são de fundamental importância uma vez que a indústria farmacêutica utiliza os parâmetros de atividade enzimática para potencializar os efeitos dos medicamentos.

5. Referências

CAMPBELL, Mary K. Bioquímica. 3 ed. Porto Alegre: Artes Médicas Sul, 2000.

HOLME, David J; PECK, Hazel. Bioquímica Analítica. Zaragoza, Espanha: Editorial Acribia, 1987.

LEHNINGHER, Arthur. et al. Princípios de Bioquímica. 2 ed. São Paulo: Sarvier Editora, 1995.

ROSCOSKI, Robert. Bioquímica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1997.

Comentários