Monografia analise da funçao dos promotores dos genes sod e fen de moniliophthora perniciosa em fungos

Monografia analise da funçao dos promotores dos genes sod e fen de...

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ANÁLISE DA FUNÇÃO DOS PROMOTORES DOS GENES SOD E FEN DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA EM FUNGOS

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Dezembro de 2008

NOME DO ALUNO:

ANÁLISE DA FUNÇÃO DOS PROMOTORES DOS GENES SOD E FEN DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA EM FUNGOS

Monografia apresentada ao Departamento de Ciências Biológicas, Campus Soane Nazaré da Universidade Estadual de santa Cruz como avaliação da disciplina de Estágio supervisionado para obtenção do grau de bacharelado em Ciências Biológicas com ênfase em Ecologia.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Júlio Cezar de Mattos Cascardo

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Dezembro de 2008

NOME DO ALUNO

ANÁLISE DA FUNÇÃO DOS PROMOTORES DOS GENES SOD E FEN DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA EM FUNGOS

Monografia apresentada ao Departamento de Ciências Biológicas, Campus Soane Nazaré da Universidade Estadual de santa Cruz como avaliação da disciplina de Estágio supervisionado para obtenção do grau de bacharelado em Ciências Biológicas com ênfase em Ecologia.

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(Avaliador) (Avaliador)

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Prof. Dr. Júlio Cezar de Mattos Cascardo

(Orientador)

Quando os nossos dias se tornarem obscurecidos por nuvens negras e baixas, quando as nossas noites forem mais negras do que mil noites. Lembremo-nos, que no universo a um grande e benigno poder, que é capaz de abrir caminho onde não há caminho, e de transformar o ontem sombrio num luminoso amanhã.

Martin Luther King

A Deus, por ter iluminado os meus caminhos sempre e a minha família pelo amor e compreensão em toda caminhada.

DEDICO

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais ___________________________________, por todo amor e compreensão sempre. Por terem confiado na minha capacidade de passar pelos obstáculos que viriam.

A meu irmão ______________, que não deixou de acreditar em mim um só momento. As palavras de incentivo e o abraço apertado que me levantaram nos momentos difíceis e o sorriso que me empurrava para frente em cada vitória alcançada.

As minhas avós _________________ pelo exemplo de vida e sabedoria. A meu avô , que não está mais entre nós, mas tenho certeza que lá de cima está me abençoando.

Aos meus tios, em especial minha tia pelo apoio e carinho incondicional

Aos meus primos e primas que compartilharam comigo todos os momentos vividos. Em especial a minha prima ________pelas palavras de conforto e incentivo.

Aos meus amigos da Rua _____________ pelas risadas, horas de conversas na porta de casa, as farofadas e principalmente por torcerem por mim sempre.

A minha, amiga, pelo apoio e dedicação nas etapas da minha vida.

Aos meus colegas de escola, família , jamais esquecerei os lugares por onde passei.

Aos meus colegas de faculdade que com o passar do tempo foram se tornando a

Àqueles professores que além de mestres, foram amigos e incentivadores. Em especialíssimo ao professor Gilson, pela amizade, paciência e dedicação sem igual.

Aos amigos e parceiros do LCT: pela cumplicidade, amizade e companheirismo.

A minha parceirinha pelo amor, amizade, ajuda e incentivo.

A por todo aprendizado, compreensão e amizade.

Ao meu orientador Júlio Cezar de Mattos Cascardo pela oportunidade de trabalho.

Acima de tudo agradeço a DEUS pelo dom da vida, por minha família e por todas as pessoas boas que colocastes em minha vida.

ÍNDICE

RESUMO

Com o projeto genoma do fungo Moniliophthota perniciosa, agente causador da vassoura-de-bruxa, doença que devastou a região cacaueira (Theobroma cacao L.), ferramentas de bioinformática do Laboratório de Bioinformática da UESC foram desenvolvidas de forma a ajudar a resolver a problemática da doença. Foi desenvolvido um programa computacional baseado em redes neurais capaz de identificar seqüencias conservada em promotores. Estes isolados da biblioteca genômica do fungo M. perniciosa, dirigindo a expressão do gene MpFen foi amplificado via PCR. O gene MpFen (flap endonuclease) codifica para uma DNA polimerase capaz de reparar danos causados ao DNA e o gene MpSod codifica para a enzima superóxido dismutase (SOD), responsável pela dismutação do peróxido de hidrogênio e conseqüentemente envolvida nas defesas contra danos causados ao DNA pelas espécies reativas de oxigênio (ROS) podendo levar a morte celular, sendo por isso importante para a sobrevivência das células. O entendimento da função de promotores é importante devido ao fato de que são os promotores que revelam quando, como e em que intensidade os genes serão ativados e a importância desses promotores se dá devido ao ambiente altamente oxidante que o M. perniciosa se encontra durante o processo de infecção da planta. Os promotores MpFen e MpSod foram retirados do vetor de propagação pGEM-T Easy, por meio de enzimas de restrição e inseridos no vetor de expressão pGREG506, dirigindo a ativação da síntese de histidina e no vetor da série pCAMBIA 1381 dirigindo a expressão do gene reporte GUS respectivamente e utilizados na transformação de Saccharomyces cerevisiae e M.perniciosa respectivamente. O promotor MpFen mostrou-se ser funcional em S. cerevisiae e o promotor MpSod também mostrou-se funcional no organismo do fungo M. perniciosa, permitindo a abertura de novas perspectivas de estudo da função dos promotores de M. perniciosa em outros tipos de fungo.

Palavras-chave: promotores, Moniliophthora perniciosa, Saccharomyces cerevisiae, MpFen, MpSod

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Diagnóstico de transformação de M. perniciosa com promotor MpFen

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Figura 2: Ensaio histoquímico para a atividade do GUS em micélios de M. perniciosa.

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Figura 3: Micélios de Moniliophthora perniciosa

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Figura 4: Colônias de S. cerevisiae após transformação com pGREG506:MpFen.

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Figura 5: Diagnóstico de transformação de S. cerevisiae.

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Seqüências de oligonucleotídeos usadas como iniciadores

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  1. INTRODUÇÃO

Definindo gene, pode-se dizer que é uma unidade de informação genética que controla um aspecto específico do fenótipo. É um segmento de DNA que codifica uma seqüência de um produto gênico final, podendo ser um RNA ou uma proteína e o mesmo dirigi e determina cada fase de desenvolvimento das características da espécie. A identificação de genes e as condições para a expressão dos transcritos são necessárias para o entendimento da constituição genética, sendo indispensável, o conhecimento das seqüências completas do gene e das regiões que o controlam.

Informações sobre as seqüências gênicas permitem determinar e/ou analisar a estrutura e a função dos genes, desde que tenham sido identificadas seqüências de DNA responsáveis pela codificação de proteínas (VIDAL, 2006), visto que estas executam as mais variadas funções no organismo, como transporte de nutrientes e metabólitos e catálise de reações biológicas (GRIFFITH et al., 2004).

Os genes possuem elementos regulatórios de DNA denominados promotores, seqüências localizadas na frente de um gene, que permite o controle e a expressão deste. É onde a RNA polimerase, orientada pelo complexo de iniciação, se liga ao DNA para definir o início da transcrição. A regulação da transcrição de um gene é realizada principalmente em regiões chamadas promotores, seqüências de DNA que sinalizam exatamente onde a síntese de RNA deve ser iniciada, ou ainda, a região que dirige a transcrição de um gene em resposta a sinais biológicos e ambientais (ZHANG, 2007). A região promotora controla quando, onde e em que intensidade o gene irá ser ativado.

Os promotores contêm seqüências específicas de DNA, os cis-elementos, que são reconhecidos pela RNA polimerase II e pelos fatores de transcrição específicos na formação do complexo de iniciação. O promotor é composto pelo segmento TATA-box (apresenta a seqüência consenso TATAAA) e o elemento iniciador (INR).

Os genes de organismos eucariotos são bastante complexos devido a sua regulação gênica ocorrer em diversos níveis (ABDELHAY, 2003). O tamanho da seqüência de promotores pode variar desde pequenas seqüências de 500 pares de bases a seqüências enormes chegando a ter sua região maior que a região codificante. Existem poucos genes que possuem a sua região promotora mapeada, isso porque as análises exigem estudos “in vitro” e “in vivo”.

Com o desenvolvimento do projeto genoma do fungo Moniliophthora perniciosa, causador da doença “vassoura-de-bruxa” no cacaueiro (Theobroma Cacao L.), diversas linhas de pesquisas vêm sendo desenvolvidas em relação à estrutura do genoma e a interação planta-patógeno. A partir disso, ferramentas de bioinformática foram desenvolvidas com o intuito de buscar soluções moleculares para o controle do fungo. Foi criado então no laboratório de Bioinformática da UESC (Labbi), um programa computacional baseado em redes neurais, capaz de identificar seqüências conservadas em promotores (VIDAL et al., 2004).

  1. OBJETIVO

A partir da problemática inserida na região com a introdução do fungo M. pernicios,a o projeto genoma tem contribuído desde então para a identificação de genes do fungo e permitindo estudos que podem ser úteis no controle da doença. Assim, o objetivo deste estudo é analisar a estrutura e função dos promotores isolados, a partir do banco de dados do projeto genoma do fitopatógeno, em Saccharomyces cerevisiae e como esses promotores se comportam no próprio Moniliophthora perniciosa por meio de transformação genética, bem como o nível de expressão gênica.

  1. REVISÃO DE LITERATURA

    1. Moniliophthora perniciosa

O cacau (Theobroma cacao L.) é a cultura mais importante na região sul da Bahia, que foi gravemente afetada pela epidemia da vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo Monilliophthora perniciosa. Este fungo foi detectado no sul da Bahia no final da década de 1980 (PEREIRA et al, 1989), diminuindo drasticamente a produção de cacau devido à falta de aplicação de tecnologia e ao abandono das propriedades rurais. Isto ocasionou um alto impacto social, com o conseqüente desequilíbrio econômico e ambiental na região, efeitos que ainda estão sendo vivenciados (RAM et al., 2004). O fungo M. perniciosa é capaz de colonizar, além do cacau, várias outras plantas hospedeiras, podendo adaptar-se às novas condições, o que contribui para o aumento da variabilidade genética desse microrganismo.

O fungo Moniliophthora perniciosa (=Crinipellis perniciosa) Stahelé um basidiomiceto, da ordem Agaricales, pertencente à família Tricholomataceae (EVANS, 1978). Foi nomeado por Singer em 1942 como Crinipellis perniciosa (GRIFFITH et al., 1994), porém recentemente foi descrito como Moniliophthora perniciosa (AIME; PHILIPS-MORA, 2005).

Este fungo é um patógeno hemibiotrófico, ou seja, apresenta em seu ciclo biológico uma fase parasítica (micélios monocarióticos) e uma fase saprofítica (micélios dicarióticos), na natureza a doença se inicia quando os basidiósporos, por meio da abertura dos estômatos infectam os tecidos meristemáticos da planta levando a uma série de sintomas, como o crescimento desordenado de ramos conhecido com vassoura-verde, bem como hiperplasia, hipertrofia, superbrotamento, associados coma perda da dominância apical (FRIAS etal., 1995; MEINHARDTetal., 2006). Após algumas semanas o fungo já se encontra na forma saprofítica, iniciando o processo de necrose das células. A partir daí, sob condições de seca e umidade, os basidiocarpos são formados por meio da frutificação do micélio secundário e novos basidiósporos serão dissipados pelo vento para infecção de novas plantas (BASTOS, 1990).

A partir do momento que a planta é colonizada pelo fungo, há uma redução da produtividade, bem como do tempo de vida do hospedeiro (RUBINI et al., 2005). Diante de tais prejuízos foi lançado em 2000 o projeto genoma do fungo M. perniciosa com o objetivo de aumentar a gama de conhecimentos acerca deste patógeno. Com base nisso, técnicas de identificação de genes de resistência do hospedeiro vêm sendo desenvolvidas num intuito de transferir tais genes para as plantas que possuam aspectos agronômicos interessantes, o que caracteriza mecanismos envolvidos nas reações de resistências e de susceptibilidade de plantas à doença (DANGL e JONES, 2001).

As pesquisas desenvolvidas com o fitopatógeno visam ampliar os conhecimentos relacionados à estrutura e função genéticas deste, a fim de obter medidas capazes de controlar a sua disseminação.

Lima et al. (2002) desenvolveram um sistema de transformação para o M. perniciosa baseado na resistência ao antibiótico higromicina, devido às dificuldades encontradas na transformação genética de alguns fungos.

    1. Análise de promotores

O gene é a unidade de função, a unidade e informação genética que controla a síntese de uma cadeia polipeptídica ou, em alguns casos, uma molécula de RNA (SNUSTAD et al, 2001). A regulação dos genes é feita em diferentes estágios da expressão gênica. O processo de expressão gênica é regulado por múltiplos pontos incluindo modificações da cromatina, controle da transcrição, splicing, transporte e controle da tradução (MOSSERI et al, 2005).

A compreensão das interações moleculares dirigindo a expressão gênica constitui a base de determinação dos eventos envolvidos na diferenciação e desenvolvimento celular, bem como para definir estratégias de mudança genética de proteínas celulares específicas. Estudos já descritos mostram a complexidade das regiões promotoras do gene, nas quais uma gama de elementos, positivos e negativos, influencia na expressão gênica.

Entre vários métodos de estudos de promotores é evidenciando a análise dos níveis de expressão do RNA, ou seja, genes que tem níveis de expressão similares, seu controle transcricional é também similar, e assim, pode compartilhar um sítio de ligação, considerando que a regulação transcricional causa níveis de expressão similares (MOSSERI et al, 2005).

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