Hemoglobina e anemia falciforme

Hemoglobina e anemia falciforme

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Diagnóstico Molecular de Anemia Falciforme

Manual da Oficina Prática de Genética, Genoma e Biotecnologia w.odnavaiaescola.org Todos os direitos reservados ao DNA Goes to School, Inc. 2004

1-Introdução à análise molecular

A prática de diagnóstico de doenças genéticas através da análise de DNA tem se tornado frequente nos últimos 15 anos, graças aos avanços na pesquisa molecular. A transferência das técnicas desenvolvidas dentro do ambiente do laboratório de pesquisa para o consultório médico tem progredido substancialmente e hoje muitas doenças genéticas, tanto as hereditárias como fibrose cística, quanto as não hereditárias, como leucemia mielóide crônica , podem ser diagnósticadas através da análise molecular. O diagnóstico molecular é uma poderosa ferramenta capaz de proporcionar informações fundamentais sobre a condição do paciente e seu prognóstico, podendo também em muitos casos auxilar o médico na escolha do melhor tratamento para o paciente. Além disso, em muitos casos, o diagnóstico molecular pode indicar quais indivíduos são portadores de um determinado alelo mutante, mesmo que o indivíduo em questão não apresente qualquer sintoma. As síndromes genéticas recessivas ligadas ao cromossomo X são um bom exemplo de síndromes onde a mãe, geralmente assintomática, apresenta 50% de chance de gerar um filho homem acometido pela doença em questão. Nestes casos a análise molecular pode indicar se a mulher em questão é de fato portadora, auxiliando não somente o médico, mas também o indivíduo testado e sua família quanto aos riscos de se gerar um indivíduo afetado. Com esta informação nas mãos a família pode buscar alternativas, como por exemplo a fertilização in vitro e posterior seleção de embriões femininos, ou mesmo a realização de exames moleculares a partir de uma célula embrionária antes do implante no útero. Neste caso, deseja-se testar se o embrião possui a mutação em questão. Com o resultado, a família decide se deseja ou não dar seguimento ao processo de implantação do embrião.

No entanto, é preciso mencionar que existe também muito debate em torno da questão do diagnóstico molecular de doenças genéticas hereditárias, e por diversas razões. A análise genética pode expor uma pré-condição antes dsconhecida ao indivíduo, podendo ter sérias implicações psicológicas para o mesmo. Além disso, há situações onde nem todos os indivíduos de uma mesma família têm a mesma posição em relação á análise genética e a realização do teste genético em um indivíduo pode expor todo o resto da família. Há ainda casos onde a decisão da realização de um diagnóstico genético está sob responsabilidade dos pais, e não do indivíduo em questão.

A maioria das doenças genéticas hereditárias ainda não possui tratamento e por isso muitos indivíduos argumentam que não há sentido em se buscar uma informação que poderá apenas trazer danos psicológicos ao indivíduo, não sendo de nenhuma forma útil para o tratamento do paciente. Além disso, em muitos países já existe a preocupação de que este tipo de informação possa ser usada por seguradoras de saúde na hora de negar cobertura ao indivíduo sob a alegação de que se trata de condição médica pré-existente. Mas há quem diga que o diagnóstico molecular pode ajudar o indivíduo a tomar certas decisões pessoais, como constituir ou não família, ter filhos, fazer seguro de vida, etc. Este tipo de debate é especialmente visto em casos de doenças genéticas de manifestação tardia como, por exemplo, a Doença de Huntington.

Conteúdo deste módulo

1-Introdução ao diagnóstico molecular 2-Anemia Falciforme 3-A molécula de hemoglobina 4-Técnicas moleculares 5-Extração de DNA de sangue 6-Reação em Cadeia da Polimerase 7-Análise com enzimas de restrição 8-Eletroforese em gel de agarose 9-Protocolo 10-Debate sobre questões éticas do diagnóstico molecular

A análise molecular pode ser realizada através de diferentes técnicas, que são definidas a partir de características moleculares específicas da doença em questão tais como ocorrência e frequência de mutações em determinadas populações, localização da mutação, características específicas do gene em questão, tipo de mutação (mutação pontual, grandes deleções, inserções, etc), entre outras. Nesta oficina nós realizaremos o diagnóstico molecular da anemia falciforme através da análise molecular de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para a mutação HbS no gene da beta-globina.

2-Anemia Falciforme

A Anemia Falciforme faz parte de um grupo de doenças genéticas recessivas hereditárias chamadas de hemoglobinopatias. As hemoglobinopatias podem consistir de variações estruturais na hemoglobina, ou de talassemias. Estas doenças podem apresentar alta incidência em regiões endêmicas de malária e são específicas de acordo com a região e população em estudo. Deste modo, o conhecimento sobre a origem étnica do paciente pode ser de grande valia na análise genética de indivíduos acometidos por algum tipo de hemoglobinopatia. Das hemoglobinopatias de variação estrutural, a de maior significado clínico é a chamada Hemoglobina S (HbS), que apresenta altas incidências na África, Arábia Saudita e Ìndia. Devido aos grandes deslocamentos e migrações de populações humanas nestes últimos 500 anos, atualmente encontra-se indivíduos afetados por diferentes formas de hemoglobinopatias no mundo inteiro. Nos Estados Unidos, por exemplo, 10% da população negra é potadora do alelo HbS.

Os indivíduos portadores de dois alelos HbS (homozigotos) são acometidos de Anemia

Falciforme. A Anemia Falciforme é caracterizada por anemia crônica e episódios de dor severa. Estes sintomas são consequência de uma alteração estrutural específica na mólecula de hemoglobina S. A hemoglobina S possuí um formato de foice que impede que a mesma circule livremente pelos capilares, podendo haver interrupção de fluxo sanguíneo e morte tissular. Já os indivíduos heterozogitos levam uma vida normal embora suas hemácias tenham uma meia-vida mais curta.

Para saber mais sobre doenças genéticas, visite o Dolan DNA Learning Center do Cold Spring Harbor Laboratory na URL http:// w.ygyh.org/

3-Hemoglobina

A hemoglobina é uma proteína levemente esférica composta por quatro subunidades: duas alfa, com 141 resíduos de aminoácidos cada uma, e duas beta com 146 resíduos. A cadeia alfa é codificada pelo gene alfa-globina enquanto a cadeia beta é codificada pelo gene beta-globina. O gene que codifica a cadeia beta (betaglobina) está localizado na região cromossômica 11p15.5 enquanto que o gene que codifica a cadeia alfa (alfaglobina) está localizado na 16p13.

Cada uma das cadeias da hemoglobina possui em seu interior um radical heme que contém um átomo de ferro (Fig 1). A hemoglobina nada mais é que um carregador do átomo de ferro, que por ser altamente reativo, deve ficar fortemente ligado à proteína quando a mesma circula pelo sangue. Esta ligação é feita através do radical heme (Fig 2). É graças á alta reatividade do ferro e grande afinidade pelo oxigênio que o mesmo pode ser transportado para todos os tecidos do corpo. Deste modo, a capacidade de circulação da hemoglobina é fundamental para que o oxigênio ligado ao átomo de ferro seja levado a todas as partes do corpo, incorporando-se em várias reações celulares e participando da produção de energia oxidativa

Figura 1: Hemoglobina com as quatro cadeias peptídicas.

que ocorre na mitocôndria. Em último caso, a capacidade de circulação da hemoglobina depende, em grande parte, de sua forma.

A forma que uma proteína adota é, antes de tudo, determinada pela chamada estrutura primária da proteína, que nada mais é que sua sequência de aminoácidos. A partir da estrutura primária, a proteína irá se desdobrar, naturalmente, em sua forma secundária, terciária e no caso da hemoglobina, quartenária. As formas secundária e terciária dizem respeito a configuração tri-dimensional adotada pela proteína enquanto a forma quartenáriaa, que não está presente em todas as proteínas, diz respeito a forma como diferentes peptídeos estão arrumados na formação de um único complexo proteíco, como no caso da hemoglobina.

O que difere a hemoglobina normal da hemoglobina S é a sequência primária de cada uma, que é determinada pela sequência de DNA. Enquanto na hemoglobina normal há o ácido glutâmico ocupando a sexta posição da seqüência, na hemoglobina S é a valina que ocupa esta posição. Esta troca é consequência da substituição de um único nucleotídeo na sequência de DNA . Ao invés do nucleotídeo adenina na posição 20 da cadeia de DNA, na sequência anormal encontra-se o nucleotídeo timina (Fig. 3). Esta simples mudança afeta a sequência de códons (GAG vira GTG), alterando a sequência de aminoácidos (ácido glutâmico vira valina alterando então a forma tridimensional da proteína (Fig. 4). A alteração conformacional ocorre porque o grupo radical da valina não possui carga elétrica, enquanto que o ácido glutâmico possui carga negativa quando num ambiente de pH 7,4 (esse valor de pH é o fisiológico e nesse valor o grupo carboxila perde um hidrogênio) e encontra-se na face externa da molécula. Assim a substituição do resíduo de ácido glutâmico por valina cria um ponto hidrofóbico de ligação na superfície externa da cadeia beta, alterando a conformação final da proteína.

A região do cromossomo 1 onde o gene da beta globina está localizado contém vários outros genes relacionados sendo a região denominada de região cluster da beta globina. Nesta região há vários polimorfismos, que podem envolver mais de um gene. Cada um dos padrões de polimorfismo é chamado de haplótipo e certos haplótipos são encontrados nos cromossomos que carregam a hemoglobina mutante (Hb S) e parecem estar associados com a severidade clínica da doença.

Haplótipo e alelo podem ser vistos como termos equivalentes. No entanto, enquanto o termo alelo é usado para designar uma das formas específicas de um gene específico, o termo haplótipo é usado quando se analisa um segmento de DNA que não necessariamente se limita a apenas um gene, podendo se estender por mais que um gene ou ainda ser apenas uma região do genoma que não codifica genes.

No homem existem 7 cadeias diferentes de hemoglobina que se associam durante o desenvolvimento para produzir 7 hemoglobinas diferentes. Cada uma dessas cadeias é codificada por um gene independente.

Figura 2: Radical hemo com o átomo de ferro no centro.

Figura 3: Sequencias de DNA das cadeias normal e mutada do gene da betaglobina

4-Doenças Genéticas e Técnicas Moleculares

Várias técnicas já existem para a realização do diagnóstico molecular. Como dito anteriormente, a técnica escolhida depende largamente das propriedades moleculares da alteração genética. De modo geral, todas as técnicas têm como princípio básico o isolamento do gene (ou região) do genoma onde localiza-se a alteração que se quer analisar. Para a realização do diagnóstico molecular é essencial que se conheça que gene, ou genes, são responsáveis pela ocorrência da doença. Atualmente já existe um grande número de genes associados à doenças, e com a finalização do sequenciamento do genoma humana este número aumenta a cada dia. Muitas doenças genéticas podem ser causadas por mais de um defeito genético, como no caso da fibrose cística onde mais de 500 mutações no gene conhecido como CFTR já foram descritas. Neste caso o diagnóstico molecular pode ser facilitado quando se conhece a mutação especifica da família. Quando não se conhece a mutação que se está buscando (por exemplo, uma família com um único caso de fibrose cística e sem antecedentes) todo o gene CFTR deve ser investigado. Além disso, há defeitos genéticos causados pela alteração de um único nucleotídeo (chamadas de mutação pontual), como no caso da Anemia Falciforme, e outros causados por deleções de fragmentos maiores na sequência de DNA, como no caso da Distrofia Muscular de Duchenne. Há ainda as doenças genéticas causadas por uma expansão de nucleotídeos repetidos, como no caso da Doença de Huntington, Síndrome do X-frágil, Distrofia Miotônica, entre outras. As mutações pontuais podem muitas vezes ser detectadas através de enzimas de restrição, que reconhecem o local específico onde está a mutação. A mutação falciforme, por exemplo, pode ser identificada através da mudança no padrão eletroforético da hemoglobina, ou através da presença ou ausência do sítio de clivagem da enzima de restrição no gene da beta globina. A mutação associada à anemia falciforme é causada pela substituição de uma adenina por uma timina em uma seqüência reconhecida pela enzima Mst I ou sua isosquimera Dde I. (veja a seguir). Nesta oficina iremos realizar o diagnóstico molecular de Anemia Falciforme através da técnica de PCR e posterior análise por enzimas de restrição de DNA extraído de sangue.

5-Extração de DNA de sangue

O isolamento de DNA humano pode ser realizado a partir de diferentes amostras, tais como sangue ou sêmen desidratado, ossos, bulbo capilar, saliva, células da pele, esfregaço anal, vaginal e bucal, tecidos derivados de biópsias ou cirurgias, tecidos mumificados, congelados, ou de líquido amniótico. Além disso, é possível coletar DNA de pontas de cigarro, tampa de caneta mordida, chiclete, pentes, sêlos, envelopes, entre outros. Estes últimos são especialmente úteis na análise molecular forense.

O processo de extração de DNA compreende basicamente três etapas; (a) quebra da membrana celular para que o núcleo seja liberado, (b) quebra da membrana do núcleo para liberação do DNA (fig 4) e (c) isolamento do DNA através de precipitação em solução com álcool e sal. O sal neutraliza Fig 4: Em organismos eucariotos, o DNA se encontra no núcleo da célula.4 a carga negativa do DNA permitindo que as várias moléculas de DNA presentes na solução possam se agregar e formar um precipitado visível em etanol, já que o DNA não é soluvel em etanol.

Estas etapas podem ser feitas com o uso de detergentes, temperatura, processos mecânicos ou processos enzimáticos. Atualmente já existe uma gama de kits comerciais para a extração de DNA dos mais variados tecidos. No caso particular da extração de DNA de sangue, é necessário que todo o grupamento heme presente nas moléculas de hemoglobinas sejam removidos, já que o ferro, por ser altamente reativo, interefere nas reações enzimáticas realizadas em seguida.

6-Reação em Cadeia da Polimerase

O princípio básico da PCR está na capacidade de, a partir de quantidades mínimas de

DNA, multiplicar uma determinada seqüência, de modo que esta se torne majoritária na amostra. Numa reação de PCR, o fragmento de DNA que desejamos multiplicar (ou amplificar) é chamado de fragmento alvo ou DNA molde e constituí um pedaço do gene que se pretende estudar (em nosso caso é o gene da beta-globina). Além do DNA molde há também os oligonucleotídeos (também chamados de primers) que nada mais são do que pequenos fragmentos de DNA complementares às extremidades da região que se pretende amplificar.

A técnica de PCR tem provocado grande impacto nas principais áreas da biotecnologia: mapeamento gênico, diagnóstico molecular, clonagem, seqüenciamento de DNA e detecção da expressão gênica. Atualmente, a PCR é utilizada para o diagnóstico de doenças genéticas, bem como na detecção de material genético presente em pequenas quantidades na amostra em análise. Como exemplo, temos a detecção e identificação de material genético de vírus como o HIV (vírus da AIDS) e HPV (Papiloma vírus), assim como a detecção de organismos genéticamente modificados em produtos alimentícios.

O método pelo qual a PCR funciona é descrito em seguida: dois pequenos fragmentos de DNA, tipicamente de 20 pares de bases, são sintetizados em laboratório.

Esses são os primers, que são complementares a cada uma das extremidades da seqüência de DNA de interesse, sempre na direção 5' > 3' (veja figura 5 ). Num tubo de reação são adicionados os primers, os nucleotídeos livres (adenina, guanina, timina e citosina), amostras de DNA que se quer analisar (DNA molde) e uma enzima especial resistente ao calor chamada Taq DNA polimerase, que promove a síntese de DNA. A mistura é aquecida a 95°C, causando a separação das duas fitas de DNA. Em seguida, a mistura é esfriada até 550C ou 650C, temperatura na qual os primers se ligam às regiões complementares das fitas de DNA que estão separadas. Neste momento, dentro do tubo de reação, todo o DNA está na forma de fita simples, menos as duas pequenas regiões nas quais os primers de 20 pares de bases se ligaram nos dois lados da seqüência de DNA de interesse. A temperatura é então elevada a 72°C, e a Taq

A técnica de

PCR foi criada em 1985 pelo Dr. Kary Mullis, nos Estados Unidos. Esta técnica é uma das grandes responsáveis por todo o avanço na área de biomedicina destes últimos 15 anos.

Kary Mullis

Fig 5: O que define a direção de cada uma das fitas é o local de ligação entre o grupo fosfato com o anel de desoxirribose. Se a ligação ocorre no carbono 3, dizemos que a fita está na direção 3’-5’; se a ligação ocorre no carbono 5, dizemos que a fita está na direção 5’-3’.

DNA polimerase começa a sintetizar um novo DNA, começando nas regiões em dupla fita, local onde cada um dos primers se ligou ao DNA molde. A Taq irá promover a síntese de DNA somente a partir da região em dupla fita. A síntese ocorre em uma taxa de aproximadamente 20 nucleotídeos/segundo, e em cerca de 30 segundos a 1 minuto uma nova cópia do fragmento que se quer analisar é sintetizada. A reação agora é novamente aquecida a 95°C, causando uma nova separação de todo DNA em fitas simples. Ao final do primeiro ciclo há duas fitas da molécula original de DNA, mais duas cópias da região de interesse. A temperatura é novamente reduzida, e agora os primers irão se ligar aos 4 sítios nas novas duas cópias e também na molécula original de DNA. A temperatura do ciclo é novamente elevada a 72°C e as 4 fitas individuais são copiadas em 8.

6 Fig 6: Esquema da PCR.

Esses ciclos são repetidos geralmente 30 vezes, num aparelho chamado termociclador. Ao final dos ciclos de amplificação existem, aproximadamente, 1 milhão de cópias do segmento de DNA de interesse para cada molécula molde originária da amostra inicial. É assim que podemos selecionar um fragmento específico dentro de todo o genoma. Veja a figura 6 para entender melhor a técnica de PCR.

7-Análise com Enzimas de Restrição

Endonucleases, também chamadas enzimas de restrição, são proteínas bacterianas que cortam em fragmentos a longa molé-cula linear de DNA. As enzimas de restrição são as principais ferramentas da tecnologia do DNA recombinante. Uma enzima de restrição reconhece uma seqüência específica de nucleotídeos, como AGCT, cortando o DNA nos locais onde esta combinação de “letras” ocorrer (fig 8). Essas enzimas são isoladas de bactérias e nomeadas com uma seqüência de três ou quatro le-tras seguidas por um número romano. Por exemplo, EcoRI é uma enzima de restrição isolada da Escherichia coli.

Parece peculiar que uma enzima como EcoRI possa existir. Por que uma bactéria produziria uma enzima que cliva o DNA numa seqüência específica de nucleotídeos? A função destas enzimas, descoberta nos anos 60 e 70, é a de destruir bacteriófagos ou vírus que invadem a bactéria. Uma vez cortados, os vírus se tornam inofensivos. As bactérias se protegem de suas próprias enzimas de restrição através da modificação química de seu DNA após a sín-tese. Esta modificação consiste na adição de um radical metil em nucleotídeos específicos ao longo da fita de DNA. Esse processo é chamado de metilação. Uma vez metilados, os nucleotídeos estão protegidos de serem digeridos pela enzima de restrição. Sendo assim, as enzimas de restrição são capazes de distinguir o DNA exógeno (do vírus) de seu próprio DNA.

A digestão de DNA por enzimas de restrição é um processo simples. Basta colocar o DNA em contato com a enzima a uma temperatura ideal (geralmente 37°C) e a enzima inicia o processo de digestão imediatamente, cortando o DNA em diversos pedacinhos. O número de pedacinhos produzido é estabelecido pelo número de sítios de restrição

A primeira enzima de restrição foi isolada em 1968 por Werner Arber, Hamilton O. Smith, e Daniel Nathans quando trabalhavam na Johns Hopkins University, nos Estados Unidos. Em 1978 os três receberam juntos o prêmio Nobel. Para saber mais sobre essa importante descoberta, visite o Nobel e-museum no link http://www.nobel.se/ medicine/laureates/ 1978/

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