Uso de Marcadores Moleculares na Zootecnia

Uso de Marcadores Moleculares na Zootecnia

FACULDADE DE IMPERATRIZ

CURSO DE ZOOTECNIA

DISCIPLINA: GENÉTICA

Uso de Marcadores Moleculares na Zootecnia

KARIELLE MORAIS BEZERRA

IMPERATRIZ – MA

2009

INTRODUÇÃO

Cada cromossomo contém uma longa e única molécula de DNA, além de proteínas que atuam no empacotamento desta molécula. As tecnologias de análise molecular da variabilidade do DNA permitem determinar pontos de referência nos cromossomos, tecnicamente denominados “marcadores moleculares”.

O rastreamento de genótipos superiores pode ser auxiliado pela técnica de marcadores moleculares, já que as variações genéticas estão relacionadas com o genoma do indivíduo. Dentro de um programa de melhoramento genético, esses marcadores podem ser usados não só para seleção de indivíduos com características de interesse, mas também para caracterização da variabilidade genética entre indivíduos, populações e em testes de paternidade.

MELHORAMENTO GENÉTICO

A maioria das características de importância econômica é controlada por vários genes sendo a maioria de pequeno efeito, e em muitas situações, o fenótipo não é uma indicação precisa do genótipo. Isto deriva do fato de que a variação genética em produtividade depende da variação alélica em um grande número de locos e a expressão gênica destes locos é altamente afetada pelos fatores do meio ambiente. Nesta situação, diz-se que a variação da característica ou a variação genética é de natureza quantitativa; e os locos individuais que afetam a expressão da característica são denominados QTL ou locos de característica quantitativa (Geldermann, 1975). Segundo Ferreira & Grattapaglia (1996), quanto maiores os efeitos do QTL sobre a característica, o tamanho da população e a herdabilidade e quanto mais próximo o marcador estiver do QTL, mais fácil será sua detecção.

O estudo dos componentes genéticos que constituem um QTL podem ser realizados por meio de marcadores genéticos que, preferencialmente, devem apresentar segregação mendeliana, variabilidade, codominância e estabilidade ao longo do desenvolvimento (Meirelles, 2007).

As composições genéticas estabelecem os padrões, limites e tipos de crescimento que o animal pode obter possibilitando a predição e seleção das mesmas pelos melhoristas (Nieto & Martins, 2003). A genômica tem gerado novas ferramentas para os programas de melhoramento e, desta forma, contribuído para elevar a eficiência e qualidade dos produtos de origem bovina. A investigação do genoma bovino permite a geração de mapas genéticos saturados e a identificação de marcadores para características quantitativas (Martinez & Machado, 2002). A utilização de testes de DNA que identificam o potencial genético dos indivíduos pelo uso de biotecnologia, mesmo em idades muito jovens, apresenta como alternativa cada vez mais promissora para auxílio em programas de melhoramento genético de bovinos de corte. Assim, a partir de uma amostra de sangue ou pelo, faz-se a análise dos marcadores moleculares e desvenda-se o potencial do indivíduo para determinada característica (Suguisawa et al., 2002).

MARCADORES MOLÉCULARES

Marcadores moleculares podem ser definidos como todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso, como no caso das isoenzimas, ou de segmento específico de DNA, a qual pode corresponder a uma região expressa do genoma ou não, que diferencia dois ou mais indivíduos (Ferreira & Grattapaglia, 1998).

Entre as vantagens atribuídas aos marcadores moleculares, destaca-se o grande polimorfismo, o fato de não sofrerem influência do meio ambiente, de serem geralmente codominantes, de poderem ser analisados em qualquer estágio de desenvolvimento do indivíduo, e de poderem caracterizar um indivíduo a partir de suas células ou tecidos (FORTES, 2007). Vários grupos de pesquisadores estão empenhados no desenvolvimento de mapas genômicos em diferentes espécies animais, dentre as quais se destacam: bovinos, aves e suínos. O objetivo é a obtenção de marcadores moleculares para todos os cromossomos, possibilitando que o potencial genético de um animal seja determinado antes mesmo da expressão do seu fenótipo, ou seja, sem avaliar a sua produção ou sua progênie (Gonsalves et al., 2005).

Com a descoberta da estrutura molecular dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) e do melhor entendimento dos eventos como replicação, transcrição e tradução, vários métodos foram desenvolvidos para simular esses eventos in vitro, permitindo a análise do DNA com o objetivo de identificar e caracterizar polimorfismos. As técnicas modernas de biologia molecular, especialmente a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), que fornece bilhões de cópias de um fragmento alvo de DNA utilizando uma DNA polimerase termoestável, facilitaram enormemente a detecção de polimorfismos genéticos diretamente no DNA (Gonsalves et al., 2005).

Desenvolvida em 1983 por Kary Mullis a PCR para sintetizar uma fita nova de DNA, necessita de um par de oligonucleotídeos iniciadores ou primers (uma única fita curta de DNA, específica para o gene que se quer estudar) que complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada (uma amostra de DNA a ser identificada) e de precursores de síntese de DNA, chamados dNTPs (desoxinucleotídeos tri-fostato ou dATP, dTTP, dCTP e dGTP). Depois da desnaturação do molde de DNA mediada pelo calor, 94 - 96°C, a temperatura é reduzida (50 - 68°C) ocorrendo a ligação dos primers a sua sequência respectiva no molde de DNA, o que é denominado de anelamento, a temperatura é elevada para 72°C, e então a enzima, DNA-polimerase, sintetiza uma fita complementar em direção à extensão 5’ e 3’ duplicando, assim, a sequência alvo escolhida (Mullis, 1990). Os ciclos de desnaturação, anelamento e extensão são repetidos várias vezes. Teoricamente, em cada ciclo a quantidade de moldes de DNA dobra, pois os produtos de um ciclo servem de molde para o ciclo seguinte e, portanto, depois de 10 ciclos a sequência alvo dentro do molde de DNA é multiplicada por 1.000 e, após 20 ciclos, é multiplicada por 1.000.000, levando ao aumento exponencial do número de cópias do DNA amplificado.

Após a PCR, os produtos da reação podem ser analisados por meio de seu perfil eletroforético, que consiste na migração dos fragmentos de DNA dentro de uma malha molecular (gel de agarose) quando submetidos a um campo elétrico. Como o DNA apresenta carga negativa (por causa dos grupos fosfato) o mesmo migra em direção ao pólo positivo, sendo que quanto menor o tamanho do fragmento de DNA, maior é a velocidade de migração ao longo do gel. A visualização dos fragmentos polimórficos de DNA no gel pode ser feita por meio da marcação das amostras com corante especifico, uma substância capaz de se intercalar entre as bases da molécula de DNA e que sob luz ultravioleta emite uma coloração, tornando visíveis os fragmentos que caracterizam o padrão polimórfico obtido da amostra.

Uma série de marcadores moleculares foi desenvolvida a partir da técnica de PCR, dentre eles os STR (Short Tandem Repeats ou microssatélites ou SSR – Simple Sequence Repeats), SNP (Single Nucleotide Polymorphism ou polimorfismo de base unica), RAPD (Random Amplified Polymorphism ou polimorfismo de DNA arbritariamente amplificado), entre outros. Outros tipos de marcadores moleculares, são obtidos por hibridização, como a RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism ou polimorfismo no comprimento dos fragmentos de restrição) e locos VNTR (Variable Number of Tandem Repeats ou variação de numero de sequência repetidas em tandem - Minissatélites).

O RFLP ocorre em função da existência ou não de sítios com sequências reconhecidas por enzimas de restrição; os VNTRs e SNPs, podem ser observados tanto em regiões codificadoras como não codificadoras do genoma (Salman et al., 2009), recentemente foi descoberto que muitos íntrons codificam RNAs intrônicos, cuja função mais provável é regular a expressão de proteínas reguladoras da transcrição genômica (Nakaya et al., 2007).

Para a detecção de RFLPs, a região contendo o polimorfismo é amplificada por PCR e depois digerida com endonucleases de restrição, que são enzimas que reconhecem e “cortam” o DNA dentro de uma sequência específica de nucleotídeos (sítios de restrição). Por exemplo, o gene LEP que apresenta uma mutação onde troca de uma Citosina (C) por uma Timina (T) codifica para a troca de um aminoácido arginina por um cisteína, que está estreitamente relacionada com o conteúdo de gordura de carcaça de animais Bos taurus, tanto nas raças de origem continental quanto nas de origem britânica (Buchanan et al., 2002). Marcadores RFLP-PCR são tipicamente co-dominantes, em que os genótipos heterozigotos e homozigotos podem ser distinguidos.

Os Microssatélites ou STRs são polimorfismos muito similares aos VNTRs, mas diferindo em seu tamanho (em geral não ultrapassam 200 pares de bases) e no comprimento das unidades de repetição em tandem, que variam de 2 a 7 nucleotídeos.

Os microssatélites receberam essa denominação porque quando se fazia análise de DNA por ultracentrifuçação em gradiente de cloreto de césio (que separa o DNA por sua densidade) apareciam bandas que ficavam ao lado da banda principal. A essas bandas foi atribuído o nome de DNA satélite, pois pareciam pequenos satélites ao lado de um planeta. Mais tarde esse DNA foi caracterizado como sendo regiões de DNA repetitivo. Depois se descobriu que as repetições podiam ser longas (satélites), curtas (minissatélites) ou muito curtas (microssatélites).

Para detecção desses polimorfismos pode-se realizar PCR com iniciadores (primers) que flanqueiam essas regiões no DNA. Como os alelos de um microssatélite geralmente apresentam números distintos de repetições e, consequentemente, tamanhos diferentes, na separação dos mesmos por eletroforese é possível detectar os genótipos da mesma forma que na técnica do RFLP ou do VNTR, só que no caso de polimorfismo microssatélite, os indivíduos homozigotos não são distinguidos dos heterozigotos, por esse motivo é considerado um marcador dominante.

A técnica geralmente aceita para testes de parentescos baseados em DNA utiliza a amplificação de microssatélites por PCR. Durante a concepção, os cromossomos de um indivíduo serão formados pela fusão do material genético do pai e da mãe. Portanto, quando se considera os cromossomos homólogos de um indivíduo sempre um é de origem paterna e o outro de origem materna.

GENES DE INTERESSE NA ZOOTECNIA

Por meio do mapeamento do genoma do Bos taurus e de estudos sobre a fisiologia do crescimento, foi possível a identificação de alguns genes que estão envolvidos na manifestação de características produtivas e que são importantes do ponto de vista de melhoramento genético de bovinos de corte, dentre os quais podemos citar como exemplos, o hormônio do crescimento (GH) e o da leptina (LEP).

O gene do hormônio do crescimento bovino (bGH), apresenta alto grau de polimorfismo, com vários sítios polimórficos (Lucy et al., 1993). Este gene exerce importantes funções biológicas na regulação do crescimento animal (Gluckman et al., 1987) e nos processos envolvidos na resistência a doenças (Arkins 1 et al., 1993).

Os polimorfismos do bGH foram associados à produção (Hoj et al., 1993, Moody et al., 1996) e quantidade de gordura do leite (Yao et al., 1996), ao peso ao nascimento (Rocha et al., 1992) e também à composição e qualidade da carne (Taylor et al., 1998).

A mutação bGH mais estudada em relação aos seus efeitos sobre as características de produção é uma transversão de C por G no exon 5 (posição 2141) responsável pela substituição de leucina (L) por valina (V) na posição 127 da cadeia polipeptídica (LUCY et al., 1993), na maioria das vezes, bovinos com genótipo VV (dois alelos mutantes do gene bGH) mostraram menor taxa de crescimento, menor ganho de peso diário e peso corporal, menor produção de carne e menor peso de carcaça. Outro estudo indicou que bovinos da raça Simental de genótipo LV apresentaram maiores valores genéticos para ganho de peso diário que os dos genótipos LL e VV (Schlee et al., 1994). Por outro lado, Zwierzcchowski et al. (2001) verificaram que touros das raças Charolês, Limousin, Red Angus, Simental e Hereford do genótipo VV apresentaram maior ganho de peso diário e, consequentemente, eram mais pesados que os dos outros genótipos. Já Di Stasio et al. (2002) não verificaram associação entre polimorfismo bGH e características de produção de carne em bovinos da raça Piemontesa. Estes resultados contraditórios provam que não é fácil avaliar os efeitos de um determinado polimorfismo sobre as características de carcaça e de crescimento. Por esse motivo, o polimorfismo V/L no gene bGH ainda não pode ser utilizado em programas de melhoramento genético.

O gene LEP codifica a leptina, que é um hormônio produzido pelo tecido adiposo e age sobre os mecanismos que regulam a ingestão, o metabolismo energético, eficiência reprodutiva e até o sistema imune (Housenknecht et al., 1998).

Os primeiros polimorfismos para o gene LEP de bovinos, 1 localizado no cromossomo BTA 4, foram descritos por Pomp et al. (1997) e Lien et al. (1997). O polimorfismo descrito por Pomp et al. (1997) apresentou relações significativas com peso corporal, deposição de gordura na carcaça e qualidade dos cortes cárneos em bovinos.

Entretanto, a descoberta de uma alteração de ponto por Buchanan et al, (2002), analisada por PCR-RFLP e localizada no exon 2 do gene da leptina de bovinos de corte, proporcionou os melhores resultados de relação com conteúdo de gordura na carcaça. Esses autores determinaram que a transição C/T que codifica para a troca de um aminoácido arginina por um cisteína, está estreitamente relacionada com o conteúdo de gordura de carcaça em animais Bos taurus, tanto nas raças de origem continental quanto nas de origem britânica.

O gene da calpaína (CAPN1), avaliado como gene candidato para QTL por Page et al. (2002) e Page et al. (2004), esta localizado no cromossomo 29 de bovinos. Calpaínas são proteases neutras ativadas por íons de cálcio, são parcialmente responsáveis pela proteólise pos mortem, conduzindo ao processo de amaciamento de carne (Gessink & Koohmaraie, 1999).

O gene CAST também codifica uma protease neutra, conhecida como calpastatina. Trata-se de uma enzima inibidora das calpaínas, sendo a principal reguladora da atividade proteolítica no pos mortem. As sequências helicoidais da calpastatina impedem as calpaínas de se ligarem às membranas (Mellgren et al., 1989). No músculo vivo, a ação elevada da calpastatina resulta na redução da degradação das proteínas (Morgan et al., 1993).

CONCLUSÃO

Os marcadores moleculares são ferramentas a serem agregadas, visando melhorar a eficiência do processo de seleção tradicional, concomitantemente, uma vez que o uso de marcadores moleculares permitiu a possível identificação de animais heterozigotos portadores de alelos favoráveis a características desejadas pelo mercado.

Logo, os conhecimentos sobre o controle genético de características de interesse econômico gerados por estudos de genética molecular auxiliarão na prática de desenvolvimento de estratégias de melhoramento e seleção.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁBICAS

CARVALHO, Thiago Dutra de – MARCADORES MOLECULARES APLICADOS À BOVINOCULTURA DE CORTE, ABRIL/2009.

Dias-Salman, Ana Karina – MARCADORES MOLECULARES NA BOVINOCULTURA DE CORTE, REDVET. Revista electrónica de Veterinaria. ISSN: 1695-7504 2009 Vol. 10, Nº 2

Fortes, Marina Rufino Salinas – Polimorfismo dos genes CAPN1, CASt, LEP, TG e DGAT1 como possíveis indicadores da qualidade da carne em bovinos zebuínos e cruzados abatidos em idade jovem, São Paulo/2007

Marcadores moleculares [on-line], Pesquisado em: <http://www.ib.usp.br/evolucao/QTL/marcadores.html>.

Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) [on-line], Pesquisado em: <http://educacao.genesisdbm.com.br/educacao_pcr.shtml>.

Enzimas de Restrição e Eletroforese em gel - Universidade de São Paulo, Instituto de Física de São Carlos, Laboratório de Biologia

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