26976266 - Histologia - e-Embriologia

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Embriologia Capítulo 2 – Fecundação: iniciando um novo organismo

Fecundação é o processo no qual duas células sexuais se fundem para criar um novo individuo com potencial genético derivado de ambos os pais. A fecundação realiza, então, duas atividades independentes: sexual (combinação dos genes) e reprodutiva (criação de novos organismos). Os principais eventos da fecundação são:

• Contato e reconhecimento entre espermatozóide e óvulo;

• Regulação da entrada do espermatozóide no óvulo;

• Fusão do material genético do óvulo e do espermatozóide;

• Ativação do metabolismo do óvulo para iniciar o desenvolvimento.

Estrutura dos gametas – Espermatozóide: Leeuwenhoek acreditava primeiro que os espermatozóides eram parasitas que viviam no sêmen humano, depois pensou que eram sementes e a mulher apenas forneciam o “solo”. Hartsoeker desenhou o “homunculus”, porém essa crença de que o espermatozóide continha um embrião inteiro, nunca foi muito aceita, pois implicava um enorme desperdício de vida em potencial. Spallazani demonstrou que filtrado, o sêmen de rã sem espermatozóide, não fecundava os óvulos(???). Prevost e Dumas descobriram que os espermatozóides não eram parasitas, mas sim agentes ativos da fecundação (“existe uma íntima relação entre sua presença nos órgãos e a capacidade fecundante do animal”). Eles propuseram que o espermatozóide realmente entrava no óvulo e contribuía concretamente para a próxima geração.

A. von Kolliker descreveu a formação do espermatozóide a partir de células testiculares, desmentiu que havia algum contato físico entre o espermatozóide e o óvulo e acreditava que o espermatozóide excitava o óvulo a se desenvolver. Hertwig e Fol demonstraram a penetração do espermatozóide no óvulo e a união dos núcleos destas células. Hertwig usou o ouriço-do-mar do mediterrâneo, não apenas por ser comum nesta região ou por se apresentar sexualmente maduro uma boa parte do ano, mas também pela grande quantidade de ovos disponíveis. Ele observou que apenas um espermatozóide podia ser visto penetrando em cada óvulo e que todos os núcleos do embrião eram derivados daqueles núcleos fundidos durante a fecundação. A fecundação foi finalmente reconhecida como a união do espermatozóide com o óvulo. Cada espermatozóide possui um núcleo haplóide, um sistema de propulsão para mover o núcleo e um saco de enzimas que torna o núcleo apto a penetrar no óvulo. Durante o processo de maturação o núcleo se torna aerodinâmico e seu DNA firmemente comprimido. À frente está a vesícula acrossômica que é derivado do complexo de Golgi e contém enzimas que digerem proteínas e açucares complexos e são usadas para digerir os envoltórios ovulares.

A principal porção motora do flagelo é denominada AXONEMA, que é formado por microtúbulos originados do centríolo localizado na base do núcleo do espermatozóide. O centro do axonema é constituído por dois microtúbulos centrais rodeados por uma fileira de nove duplas de microtúbulos e são constituídos de uma proteína chamada tubulina. A dineína está ligada aos microtúbulos, ela pode hidrolizar moléculas de ATP e converter a energia química em energia mecânica que impulsiona o espermatozóide. A energia para mover o flagelo é proveniente dos anéis de mitocôndria localizados na região da peça intermediaria do espermatozóide.

Óvulo: todo o material necessário para iniciar o crescimento e desenvolvimento deve estar estocado no óvulo maduro. O espermatozóide elimina a maior parte do seu citoplasma, o óvulo em desenvolvimento não só conserva o seu material como está ativamente envolvido em acumular mais. Ele tanto sintetiza como absorve proteínas, como o vitelo, por exemplo, que constitui reserva de alimento para o embrião em desenvolvimento. Este rico citoplasma inclui:

• Proteínas: são suficientes até o embrião estar pronto pra se alimentar pos si só, muitas destas proteínas do vitelo são produzidas pelos órgãos da mãe e transportadas para o óvulo;

• Ribossomos e tRNA: há uma repentina síntese protéica logo após a fecundação efetuada pelos ribossomos e tRNA que já existem no óvulo. O óvulo em desenvolvimento tem mecanismos especiais para sintetizar ribossomos;

• RNA mensageiro: as mensagens para a síntese de proteínas, utilizadas durante o inicio do desenvolvimento, já estão empacotadas no ovócito;

• Fatores morfogênicos: moléculas que dirigem a diferenciação das células em determinados tipos celulares. Sobre a membrana plasmática está o envoltório vitelínico. Esta membrana glicoprotéica é essencial para a ligação espécie-específica do espermatozóide. Em mamíferos o envoltório é bastante espesso, sendo chamado de zona pelúcida. O óvulo de mamíferos está também rodeado por uma camada de células, as células do cumulus, que representam as células foliculares ovarianas que nutrem o óvulo quando este deixa o ovário. O espermatozóide deverá passar por estas células para fecundar o óvulo.

Abaixo da membrana plasmática há o córtex. O citoplasma dessa região é mais gelatinoso por causa das altas concentrações de moléculas globulares de actina que durante a fecundação polimerizam para formar longos fios de actina conhecidos como microfilamentos. Presentes também no córtex estão os grânulos corticais que são organelas derivadas do complexo de golgi que contêm enzimas proteolíticas, mucopolissacarídeos e proteína hialina. As enzimas e os mucopolissacarídeos são ativos na prevenção da entrada de outro espermatozóide no óvulo, depois que o primeiro tenha entrado e moléculas de proteína hialina rodeiam o embrião jovem dando-lhe suporte durante o estagio de clivagem dos blastômeros. Reconhecimento entre espermatozóide e óvulo: na fecundação externa: (1) como podem o espermatozóide e o óvulo se encontrarem em concentrações tão baixas?; (2) que mecanismo impede o espermatozóide da estrela-do-mar de tentar fecundar o óvulo do ouriço-do-mar?

Ovos secretam um fator quimiotático que atrai o espermatozóide e regulam também o momento no qual esse fator será liberado (resacina). A fusão da vesícula acrossômica é causada pela fusão, mediada pelo cálcio, da membrana acrossômica com a membrana plasmática adjacente do espermatozóide. Além de causar a extensão do processo acrossômico, este significante aumento do pH é também responsável pela ativação da dineína ATPase, localizada no pescoço do espermatozóide. Esta ativação causa uma rápida utilização do ATP e um aumento de 50% na respiração mitocondrial. A geléia do ovo pode promover um reconhecimento do tipo espécie-específico em algumas espécies mas não em outras. O processo acrossômico do espermatozóide contata a camada externa do envoltório vitelínico do óvulo, esse é o principal passo do reconhecimento espécie-específico e a proteína mediadora é a bindina. Bindinas de espécies muito próximas são de fato diferentes. Esta descoberta implica na existência de receptores espécie-específicos para bindina, no envoltório vitelínico.

Mamíferos – reconhecimento e ligação dos gametas – capacitação: espermatozóides recém-ejaculados são incapazes de sofrer a reação acrossômica sem que tenham permanecido por um certo tempo no trato reprodutivo feminino. Este prérequisito para capacitação varia de espécie para espécie e pode ser mimetizado in vitro.

Ligação primaria do espermatozóide à zona pelúcida: a camada mais externa é composta pelas células do cummulus e sua matriz, rica em ácido hialurônico. Estas células do cummulus são remanescentes das células da granulosa do folículo ovariano e acompanham o óvulo durante a ovulação. Em algumas espécies as células do cummulus não estão presentes no momento da fecundação, mas elas não constituem barreira para o espermatozóide mesmo quando estão presentes. A especificidade da ligação do espermatozóide à zona é relativa, mas não absolutame4nte espécie-específica (em fecundações internas especificidade desse tipo não deveria ser um grande problema) e a ligação do espermatozóide de camundongo à zona pelúcida de camundongo pode ser inibida por uma incubação previa do espermatozóide com glicoproteínas da zona pelúcida. ZP1 e ZP2 não competem pela ligação com o espermatozóide.

Um conjunto de proteínas no espermatozóide, capazes de reconhecer um carboidrato especifico e regiões da proteína ZP3 da zona pelúcida do óvulo, parece ser a hipótese mais provável para a ligação entre os gametas de mamíferos. Existem três proteínas, no espermatozóide, que são capazes de se ligar à zona pelúcida. (1) proteína que se liga aos resíduos de galactose da ZP3; (2) enzima presente na membrana celular do espermatozóide; (3) protease. Indução da reação acrossômica pela ZP3: a aglutinação dos receptores de espermatozóides para ZP3 é necessária para a reação acrossômica. A ZP3 poderia provocar uma liberação de íons cálcio dentro do espermatozóide. O receptor está acoplado à proteína de ligação ao GTP (proteína- G) que é ativada quando o receptor se liga ao seu sítio ativo específico. A proteína-G ativada, ativa uma enzima que quebra um lipídio de membrana e é capaz de liberar íons cálcio ligados a compartimentos da membrana. Tal proteína-G foi descoberta em espermatozóides de mamíferos e parece ser ativada pela ligação com ZP3. Além disso, se a ativação da proteína-G é inibida, o espermatozóide pode se ligar a ZP3, mas não sofre a reação acrossômica. Ligação secundária do espermatozóide à zona pelúcida: a porção anterior da membrana plasmática do espermatozóide é desprendida dele. Aí estão localizadas as proteínas de ligação à ZP3. Porém, o espermatozóide precisa permanecer ligado à zona pelúcida para lisar um caminho através dela. Esta ligação secundaria à zona é completada por proteínas na membrana acrossômica interna que se ligam à ZP2. O acrossomo intacto não poderá se ligar à glicoproteína ZP2, mas o acrossoma do espermatozóide que já reagiu o fará. A estrutura da zona é constituída por unidades repetidas de ZP3 e ZP2, ocasionalmente, ligadas pela ZP1. Parece que o acrossoma que já reagiu transfere suas ligações de ZP3 para ZP2 adjacente. Após a entrada do espermatozóide no óvulo seus grânulos corticais liberam seu conteúdo e uma dessas proteínas é uma protease que altera especificamente ZP2. Esta inibiria o espermatozóide que já sofreu reação acrossômica de entrar mais profundamente no óvulo. Em suínos a proacrosina é uma proteína que se liga à fucose que mantém a conexão entre o espermatozóide cujo acrossomo que já reagiu e a zona pelúcida. Contracepção pelos anticorpos: se animais machos e fêmeas são injetados com extratos de espermatozóides, muitos produzirão anticorpos e se tornarão inférteis. Primakoff descobriu uma proteína do espermatozóide de cobaia que poderia induzir este tipo de esterilidade. O soro desses animais continha altas concentrações de anticorpos conta a proteína PH-20m que está presente tanto na membrana plasmática como na membrana interna do acrossomo do espermatozóide de cobaia. Outra forma de contracepção imunológica por longos períodos foi conseguida produzindo-se anticorpos contra a zona pelúcida (ZP3). Fusão dos gametas e prevenção da poliespermia: o reconhecimento é seguido pela lise de uma porção do envoltório que contata a cabeça do espermatozóide. Esta lise é seguida pela fusão da membrana celular do espermatozóide com a membrana celular do óvulo. A fusão espermatozóide-óvulo parece causar a polimerização da actina e extensão de muitas microvilosidades do óvulo, para formar o cone de fecundação. As membranas do óvulo e do espermatozóide se fundem e o material da membrana celular do espermatozóide pode, mais tarde, ser encontrado na membrana do óvulo. Nem todos os componentes da membrana do espermatozóide podem se misturar com a do óvulo. Algum material parece estar localizado no ponto de entrada do espermatozóide. Suspeitam que essa localização dos componentes do espermatozóide em uma área restrita provoca uma assimetria celular, que auxilia diretamente o plano da primeira clivagem e os movimentos citoplasmáticos dentro do ovo. Fusão é um processo ativo, frequentemente mediado por proteínas “fusogênicas” específicas. A entrada de múltiplos espermatozóides – poliespermia – traz, para a maioria dos organismos, conseqüências desastrosas. O núcleo triplóide e o par extra de centríolos causam a distribuição desigual dos cromossomos. Algumas células poderiam receber cópias extras de certos cromossomos os quais faltariam em outras células. O modo mais comum é prevenir a entrada de mais de um espermatozóide no óvulo. Existem dois mecanismos principais para prevenir a poliespermia: uma reação rápida, alcançada através de uma alteração elétrica na membrana plasmática do óvulo e uma reação mais lenta, provocada pela exocitose dos grânulos corticais. O bloqueio rápido à poliespermia: alcança seu objetivo mudando o potencial elétrico da membrana do óvulo. A concentração iônica do óvulo é deferente da do ambiente, e isso é especialmente diferente para os íons potássio e sódio. No caso do ouriço-do-mar, a água do mar tem uma concentração particularmente alta de íons sódio, enquanto que o citoplasma do óvulo tem relativamente pouco sódio livre. Com os íons potássio acontece o inverso. Essa condição é mantida pela membrana celular, o potencial de membrana em repouso é -70mV. De 1 a 3 segundos após a ligação do primeiro espermatozóide, o potencial de membrana se desloca para um nível positivo. Um pequeno influxo de íons sódio para dentro do óvulo é permitido, elevando assim a diferença de potencial para +20mV. O espermatozóide não pode se fundir com membranas que têm uma ddp positiva. A abertura dos canais de sódio no óvulo parece ser causada pela ligação do espermatozóide ao óvulo. O bloqueio elétrico à poliespermia provavelmente não ocorre na maioria dos mamíferos e só é efetivo quando o espermatozóide possui um componente que é sensível à diferenças de voltagem. Bloqueio lento da poliespermia: a poliespermia pode ainda ocorrer se os espermatozóides ligados ao envoltório vitelino não são de alguma forma removidos. Esta remoção é efetivada pela reação dos grânulos corticais. Estas vesículas contêm a proteína hialina, proteases, uma peroxidase e mucopolissacarídeos. Após a entrada do espermatozóide, estes grânulos corticais se fundem com a membrana plasmática do óvulo liberando seu conteúdo na área entre a membrana e o envoltório vitelínico. As proteínas que ligam o envoltório vitelínico ao óvulo são dissolvidas pelas enzimas proteolíticas liberadas e os mucopolissacarídeos, recém liberados, produzem um gradiente osmótico que permite a entrada de água no espaço entre a membrana celular e o envoltório vitelínico, que é então elevado e passa a ser denominado membrana de fecundação. Primeiro, as proteases modificam ou removem o receptor de bindina e algum espermatozóide ligado a ele. Segundo, a peroxidase endurece a membrana de fecundação pela ligação de resíduos de tirosina às proteínas adjacentes. A membrana de fecundação começa a se formar no local da entrada do espermatozóide e se expande ao redor do óvulo. Tão logo o envoltório de fecundação se forma a proteína hialina é estocada nos grânulos corticais, forma uma cobertura ao redor do óvulo. A célula estende microvilosidades longas cujas extremidades se ligam à camada hialina. Este envoltório hialino constitui suporte para os blastômeros durante a clivagem. Em mamíferos a reação dos grânulos corticais não produz uma membrana de fecundação, mas o efeito é o mesmo. A liberação de enzimas modifica os receptores dos espermatozóides na zona pelúcida de tal forma que eles não podem mais se ligar aos espermatozóides (reação de zona) em seguida à fusão dos grânulos corticais próximos ao ponto de entrada do espermatozóide, uma onda de exocitose dos grânulos corticais se propaga ao redor do córtex em direção ao lado oposto do ovo. Íons de cálcio são diretamente responsáveis pela propagação da reação cortical e estão estocados no próprio óvulo, dentro do reticulo endoplasmático. Variações nas estratégias que previnem a poliespermia estão amplamente distribuídas na natureza. Fusão do material genético: após a fusão das membranas do espermatozóide e do óvulo, o núcleo e o centríolo do primeiro se separam das mitocôndrias e do flagelo, sendo que esses se desintegram dentro do óvulo. O núcleo do óvulo, ainda haplóide, é denominado pronúcleo feminino. Dentro do citoplasma do óvulo, o núcleo do espermatozóide de descondensa para formar o pronúcleo masculino. As proteínas ligadas à cromatina do espermatozóide, em seu estado condensado e inativo, são trocadas por proteínas semelhantes, derivadas do óvulo. Esta troca permite a descondensação da cromatina do espermatozóide. Pedaços remanescentes do envoltório nuclear original do espermatozóide são transportados pela cromatina. Rapidamente novas vesículas membranosas se agregam ao longo da periferia da massa de cromatina e se conectam com os fragmentos do velho envoltório para produzir a nova membrana do pronúcleo masculino. Esse sofre uma rotação de 180º, de tal forma que o centríolo do espermatozóide fica entre os dois pronúcleos. Os microtúbulos do centríolo do pronúcleo masculino se estendem e conectam o pronúcleo feminino e ambos migram para se encontrarem. A fusão forma o núcleo zigótico diplóide. O início da síntese de DNA pode ocorrer ainda na fase de pronúcleo ou após a formação do núcleo zigótico. O pronúcleo masculino de mamíferos aumenta em tamanho enquanto o núcleo do ovócito completa sua segunda divisão de meiose. Então, cada pronúcleo migra para se encontrar com o outro, replicando seu DNA enquanto viaja. No encontro, os dois envoltórios nucleares se tocam e rompem. Contudo, em vez de produzir um núcleo zigótico comum, a cromatina se condensa em cromossomos que se orientam para um fuso mitótico comum. Então podem ser vistos verdadeiros núcleos diplóides em mamíferos, não no zigoto, mas na fase de duas células. A não equivalência dos pronúcleos de mamíferos: os pronúcleos masculino e feminino e mamíferos são geneticamente equivalentes, porém podem ser funcionalmente diferentes. A mola hidatiforme é um tumor que se desenvolve a partir de um espermatozóide haplóide que fecunda um óvulo cujo pronúcleo feminino está ausente. O desenvolvimento não ocorre nesse caso. Estas diferenças podem estar em modificações do DNA que são diferentes nos núcleos dos óvulos e dos espermatozóides. Ativação do metabolismo do óvulo: o óvulo maduro é uma célula inerte, que é reativada pela entrada do espermatozóide. Esta ativação é meramente um estímulo, contudo, transforma em ação um conjunto de eventos metabólicos pré-programados. As respostas do óvulo ao espermatozóide podem ser: (1) respostas imediatas – muitos experimentos demonstram que esta liberação de cálcio é essencial para a ativação do desenvolvimento do embrião. A liberação de cálcio é responsável pela ativação de uma serie de reações metabólicas. Uma delas é a ativação da enzima NAD+ quinase, que converte NAD+ em NADP+ . Esta mudança deve ter importantes conseqüências para o metabolismo da célula. Uma delas envolve o metabolismo dos lipídios. Assim, a mudança de NAD+ para NADP+ pode ser importante na construção de muitos componentes das novas membranas celulares. Um outro efeito desta mudança envolve o consumo de oxigênio. Uma súbita redução do oxigênio é verificada durante a fecundação. A enzima responsável pela redução do oxigênio é dependente de NADPH. (2) respostas tardias – acoplado ao aumento intracelular de cálcio livre está um aumento do pH intracelular. Esse aumento inicia-se com um segundo influxo de íons sódio, causando a troca de um íon sódio que entra novo por um íon de hidrogênio que vai para a água do mar. Esta perda de íons de hidrogênio provoca uma alteração no pH que aumenta de 6,8 para 7,2 e traz enormes mudanças na fisiologia do ovo. Ainda que se acredite que esta mudança seja causada por uma reação mediada por cálcio, tem sido verificado que independente da causa, o aumento do pH intracelular pode iniciar muitas das respostas tardias, essas incluem a ativação da síntese de DNA e da síntese protéica, para a qual são suados mRNA’s já presentes no citoplasma do ovócito. Agentes que bloqueiam o aumento do pH também bloqueiam esses eventos tardios da fecundação. A bioquímica da ativação do óvulo: a ativação do óvulo é causada por uma onda de liberação de cálcio de compartimentos internos da célula. A ligação do espermatozóide à membrana celular do óvulo provoca uma serie de reações envolvendo enzimas da membrana que sintetizam “mensageiros secundários” (inositol 1,4,5 – trifosfato {IP3} pode liberar íons cálcio). O IP3 liberado nesta reação se liga a uma proteína no reticulo que libera íons cálcio. A proteína-G está envolvida na liberação dos íons cálcio ligados e na exocitose dos grânulos corticais. Parece que a mesma química que permite ao óvulo ativar o espermatozóide também permite ao espermatozóide ativar o óvulo. Rearranjo do citoplasma do óvulo: a fecundação pode também iniciar o deslocamento radical do material citoplasmático. Estes arranjos do citoplasma do ovócito são frequentemente cruciais para a diferenciação celular durante o desenvolvimento. O citoplasma de óvulo freqüentemente contém determinantes morfogênicos que se segregam em células específicas durante a clivagem. Esses determinantes conduzem à ativação ou à repressão de genes específicos e consequentemente conferem certas propriedades às células que os incorporam. O arranjo espacial correto destes determinantes é crucial para o desenvolvimento normal. O crescente amarelo, que se estende do pólo vegetal ao equador traz o plasma amarelo para a área onde futuramente os músculos serão formados na larva do tunicado. O movimento destas regiões citoplasmáticas é dependente de microtúbulos que provavelmente são gerados pelo centríolo do espermatozóide. O citoplasma subjacente, localizado próximo ao equador, do lado exatamente oposto ao ponto de entrada do espermatozóide é o crescente cinzento, que marca a região onde a gastrulação é iniciada em embriões de anfíbios. O motor desses movimentos citoplasmáticos em ovos de anfíbios parece ser o arranjo paralelo dos microtúbulos que se situam entre o citoplasma cortical e o citoplasma interno do hemisfério vegetal. A orientação dos microtúbulos é paralela à direção da rotação do citoplasma. Os microtúbulos paralelos são originários do óvulo, mas parece que o áster do espermatozóide dá a orientação aos microtúbulos. Esses movimentos citoplasmáticos iniciam uma cascata de eventos que determinam o eixo dorso-ventral. Preparação para clivagem: o aumento intracelular de íons cálcio livres também movimenta a aparelhagem da divisão celular. Os mecanismos através dos quais a clivagem é iniciada, provavelmente diferem entre as espécies. O ritmo das divisões celulares é regulado pela síntese e degradação da ciclina, que mantém a célula em metáfase e a quebra da ciclina permite à célula retornar à interfase. Clivagem, o evento que separa a fecundação da embriogênese. A posição da primeira clivagem não é ao acaso, mas, tende a ser determinada pelo ponto de entrada do espermatozóide e a subseqüente rotação do citoplasma do ovo. A coordenação do plano de clivagem e os rearranjos do citoplasma são provavelmente mediados pelos microtúbulos do áster do espermatozóide.

Histologia básica 1 – A histologia e seus métodos de estudo

A histologia estuda as células e o material extracelular que constituem os tecidos do corpo. O ME que é 1000 vezes mais potente que o MO ampliou bastante o campo de estudo da histologia, assim como outros instrumentos e técnicas de estudo como a cultura de células, as técnicas de radioautografia e de imuno-histoquímica. Como são feitas as lâminas histológicas: o que se deseja é levar ao microscópio um preparado no qual os tecidos estejam perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivos. A fixação estabiliza os tecidos: para que a célula não se destrua (autólise), ou bactérias não a destruam, os tecidos devem ser tratados imediatamente após sua retirada. Esse tratamento é denominado fixação, cuja principal função é insolubilizar as proteínas do tecido. Um dos melhores fixadores para o MO é o formaldeído a 4% em solução tamponada. No ME são usadas duas fixações, primeiro em solução tamponada de aldeído glutárico, e em seguida, em solução também tamponada, de tetróxido de ósmio.

EtapasFinalidades Durações

1. Fixação em fixador simples ou em mistura fixadora (liquido de Bouin, Helly etc.).

Preservar a morfologia e a composição dos tecidos.

Cerca de 12 hs, dependendo do fixador do tamanho da peça.

2. Desidratação em álcool etílico de concentrações crescentes, começando com álcool a 70% e terminando com álcool absoluto.

Remover a água dos tecidos. 6 a 24hs, dependendo do tamanho da peça.

3. Clareamento ou diafanização em benzol, xilol ou toluol, solventes do álcool e da parafina.

Embeber a peça em substancia miscível com a parafina. 1 a 6hs, dependendo o tamanho da peça.

4. Impregnação pela parafina fundida, geralmente realizada em estufa a 60ºC.

A parafina penetra nos vasos, nos espaços intercelulares e mesmo no interior das células, impregnando o tecido e tornando mais fácil a obtenção dos cortes no micrótomo.

30 min a 6hs, dependendo do tamanho da peça.

5. Inclusão: a peça é colocada num molde retangular contendo parafina fundida.

Obtenção do bloco de parafina de forma regular, para ser cortado no micrótomo.

Após a fixação os tecidos são impregnados com parafina ou resinas sintéticas a fim de que possam ser cortados em fatias finas: para a obtenção dos cortes os tecidos tem que ser embebido e envolvidos em substancias de consistência firme (parafinas ou resinas plásticas). Há uma série de tratamentos que o tecido deve sofrer antes da impregnação. Na primeira etapa, a desidratação, a água é extraída dos tecidos pela passagem dos mesmos em banhos de concentrações crescentes de etanol, geralmente de 70% até o etanol absoluto (ou puro ou 100%). Em seguida, o etanol é substituído por um liquido miscível como meio de inclusão. Para a inclusão em parafina usa-se o xilol ou benzol. Os tecidos embebidos nessas substancias tornam-se translúcidos, por isso essa etapa é chamada diafanização ou clareamento. Mergulha-se o tecido em parafina a

60ºC. Devido ao calor o xilol ou benzol evaporam e os espaços anteriormente ocupados por eles são ocupados pela parafina. Em seguida coloca-se o tecido num recipiente contendo um pouco de parafina fundida e deixa solidificar em temperatura ambiente formando um bloco de parafina como tecido no seu interior, que é seccionado pela navalha de aço do micrótomo, obtendo-se cortes de 6 a 8 µm de espessura. Esses cortes são estirados em água quente e colocados nas lâminas. A imersão dos tecidos em etanol e xilol ou benzol retira os lipídios, quando são eles que se quer estudar usa-se o micrótomo de congelação. A coloração facilita a visualização dos componentes teciduais: a maioria dos tecidos é incolor. A maioria dos corantes utilizados em histologia comporta-se como ácido ou base e tende a formar ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos. Os componentes basófilos têm caráter ácido e se ligam aos corantes com caráter básico, já os acidófilos têm caráter básico e se ligam aos corantes com caráter ácido. Azul-detoluidina, azul-de-metileno e a hematoxilina são corantes básicos, enquanto orange G, eosina e fucsina ácida são corantes ácidos. O núcleo celular é basófilo e o citoplasma é quase sempre acidófilo. A coloração dupla pela hematoxilina e a eosina (HE) é a mais utilizada na rotina em histologia, porem muitos outros corantes são usados. Além dos corantes usa-se também a impregnação metálica com sais de prata e ouro.

Técnicas Constituintes Núcleos Citoplasma Fibras colágenas

Fibras elásticas

Fibras reticulares

HE Hemalúmen (hematoxilina) Azul ---- ---- Irregular ----

Eosina ---- Róseo Róseo Irregular ----

Tricrômico de Masson

Fucsina ácida e ponceau de xilidina

Fucsinaresorcina de Weigert

Impregnação argêntica para fibras reticulares

Soluções de sais de prata

O microscópio óptico não permite o estudo de detalhes com menos de 0,2µm: a parte óptica do microscópio consiste em três sistemas de lentes: condensador, objetiva e ocular. A ampliação total dada pelo MO é igual ao aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular. O fator mais significativo para uma boa imagem é a resolução, que é a menor distancia para que duas partículas apareçam como objetos separados. O limite da resolução dos melhores MO é 0,2µm e ele depende essencialmente da objetiva, a ocular apenas aumenta de tamanho a imagem projetada de foco pela objetiva.

Os microscópios de contraste de fase facilitam a visualização das células e tecidos vivos: o estudo de tecidos vivos é difícil, pois a maioria dos seus componentes são incolores e transparentes. O microscópio de contraste permite o estudo de muitos detalhes celulares in vivo. A velocidade com que a luz atravessa um corpo transparente depende da quantidade de matéria presente e determina o índice de refração desse corpo. Quanto maior a densidade, maior o índice de refração e menor a velocidade da luz no corpo. Como as diversas estruturas celulares têm índices diferentes, causam atrasos diferentes nas ondas luminosas dando origem a diferenças de fase entre as ondas luminosas emergentes, mas essas diferenças ao são visíveis. No microscópio de contraste de fase existem dispositivos especiais que transformam essas diferenças de fase em diferenças de amplitude, dando diferenças de intensidade luminosa, para as quais a retina é sensível. Cortes ópticos podem ser obtidos com o microscópio confocal: este tipo de microscópio utiliza raios laser e gera imagens de planos ópticos do tecido em exame. Isto torna possível imagens muito nítidas porque o material situado abaixo do plano de foco não contribui para a formação da imagem e, assim, não compromete sua nitidez.

O microscópio de polarização revela a presença de moléculas alongadas e orientadas: ao atravessar um filtro polariode a luz torna-se polarizada. Colocando-se um segundo filtro no microscópio, acima do primeiro e com seu eixo perpendicular, a luz não atravessa o conjunto. O primeiro filtro é colocado no condensador e recebe o nome de polarizador. O segundo filtro, ou analisador, é colocado entre a objetiva e a ocular. Quando o polarizador e o analisador estão com seus eixos perpendiculares, o campo do microscópio aparece escuro, mas se entre os dois filtros existirem estruturas contendo moléculas orientadas (anisotrópicas ou birrefringentes, modificam o eixo da luz recebida do polarizador), estas estruturas aparecerão brilhantes contra um fundo escuro. Microscopia de fluorescência: quando excitadas por certos comprimentos de onda, algumas substâncias absorvem energia e emitem luz de maior comprimento de onda. Em microscopia utiliza-se a citação com radiação ultravioleta, para que a radiação emitida caia na faixa de luz visível. As substancias fluorescentes aparecem como substancias brilhantes contra um fundo escuro. Microscopia eletrônica: os elétrons são produzidos graças ao aquecimento no vácuo de um filamento que então emite elétrons. Essas partículas são aceleradas devido a uma ddp de 60 a 100 kV existente entre o filamento e o anodo. Devido ao fato de serem elétrons facilmente desviados pelo objeto, torna-se necessário utilizar cortes muito finos de tecido (20 a 100 nm de espessura). Para isso foi necessário desenvolver métodos especiais de microtomia, os cortes são feitos em um ultramicrótmo, nos quais são utilizadas navalhas de vidro ou diamante. Enquanto no MO a luz é absorvia pelas estruturas coradas, no ME os elétrons são desviados por porções do objeto que contenham átomos de elevado peso atômico. O resultado é que as estruturas que desviam elétrons aparecem escuras na tela fluorescente e são chamadas de elétrondensas. A capacidade de desviar os elétrons depende do numero atômico, por isso se costuma impregnar os cortes de tecidos com metais pesados a fim de aumentar o contraste, resultando assim uma imagem nítida e bem visível.

A analise dos elétrons refletidos permite o estudo da superfície de células e tecidos especialmente preparados: alem do ME já descrito, chamado de transmissão, existe outro tipo, denominado microscópio de varredura aqui, entre lente eletromagnética e o objeto é interposta uma bobina de varredura que provoca um desvio no feixe de elétrons, de tal modo que o mesmo vai incidir sobe o objeto ponto por ponto, numa seqüência determinada. O objeto não se deixa atravessar pelo feixe eletrônico, devido a sua espessura e a uma cobertura feita por evaporação de metal pesado sobre a sua superfície. Desse modo, o feixe de elétrons que incide sobre o objeto (feixe primário) sofre reflexões, originando elétrons secundários, os quais são captados por detectores especiais que geram um sinal elétrico, transferido para um tubo de vídeo.

O uso combinado de moléculas radioativas e suspensões de brometo de prata em gelatina (emulsões fotográficas) é a base da técnica radioautográfica: essa técnica torna possível a localização de substancias radioativas nos tecidos. Cristais de brometo de prata agem como microdetectores da radioatividade, pois atingidos pela radiação, depois de revelados, transformam-se em grãos de prata metálica, que aparecem negros ao microscópio, denunciando a presença de radioatividade nas estruturas com as quais estão em contato. Esse método tem sido utilizado para o estudo de fenômenos biológicos. Por exemplo, a síntese de proteínas pode ser estudada pela injeção de aminoácidos marcados com carbono 14 e hidrogênio 3, as moléculas que se formarem serão radioativas e poderão ser encontradas pela radioautografia.

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