Tecnologiafermentações, Notas de estudo de Biotecnologia

Baixe Tecnologiafermentações e outras Notas de estudo em PDF para Biotecnologia, somente na Docsity! Tecnologia das Fermentações Cinética de Utilização de Substrato, Formação de Produtos e Produção de Biomassa. Forma de Condução do Processo: Sistemas Descontínuo, Descontínuo Alimentado e Contínuo 1 Autor: Professor Dr. Dile P. Stremel 01) Tente descrever como é o crescimento populacional e o ambiente no qual se desenvolve uma cultura celular. Quais fenômenos ocorrem, dificuldades de modelagem cinética, etc. De acordo com a morfologia, durante o crescimento celular, organismos unicelulares que se dividem aumentam em biomassa de acordo com o número de células presente. Quando considerando organismos como os mofos ou bolores (fungos), o comprimento e número de micélios(conjunto de hifas) aumentam enquanto o organismo cresce. O crescimento dos mofos aumenta em tamanho e densidade mas não necessariamente em números. Associados com o crescimento estão dois outros processos: consumo de material do ambiente celular e liberação de metabólitos e produtos finais no meio. As alterações nos processos variam amplamente enquanto o crescimento ocorre. As células consomem nutrientes e convertem substratos do ambiente em produtos. A célula gera calor e por sua vez a temperatura do meio fixa a temperatura das células. Interações mecânicas ocorrem através da pressão hidrostática e efeitos de fluxo do meio para as células e das mudanças na viscosidade devido ao acúmulo de células e produtos metabólitos celulares. O Ambiente no qual o microorganismo se desenvolve, ou meio, nota-se que é um sistema multicomponente que deve conter todos os nutrientes enquanto a célula cresce e diferentes produtos se. A célula produz componentes que influenciam o pH do meio, que por sua vez influencia a atividade celular e processos de transporte. Durante o curso de reações celulares, a temperatura do caldo, pH, força iônica e propriedades reológicas podem mudar com o tempo. O ambiente celular é freqüentemente um sistema multifásico consistindo de meio líquido disperso com gás ou um sistema líquido-líquido no qual fases imiscíveis estão presentes, ou algumas vezes um sistema trifásico com duas fases líquidas e uma gás Quanto à característica da população celular, cada célula é um sistema multicomponente complexo que não é homogêneo, nem mesmo a nível celular. Muitas reações independentes ocorrem simultaneamente na célula, sujeito a controles de adaptação internos. Estes controles internos proporcionam à célula a capacidade e a propriedade de se adaptar a atividades e tipos de reações que ocorrem na célula como função do ambiente celular. Em longos tempos de cultivo podem ocorrem mutações ou o sistema pode forçar à um deslocamento genético da população. Além do mais, em uma cultura de crescimento , encontra-se significante heterogeneidade célula a célula. Isto é, a nível unicelular, diferentes células na população em um dado ponto no tempo e em um dado ponto ou região no espaço variam com respeito à idade. Claramente, não é possível formular um modelo cinético que inclua todas as características mencionadas. No entanto é possível formular algumas aproximações e simplificar a representação do sistema de forma a representar a cinética populacional. Com respeito ao ambiente é prática comum formular o meio de forma que todos os componentes, exceto um estejam presentes em concentrações suficientemente elevadas, de forma que a variação nas concentrações dos demais não altere significativamente as taxas globais. Desta forma um nutriente torna-se limitante e deve-se considerar somente a concentração deste componente quando analisando os efeitos da composição do meio na cinética de crescimento. Ocasionalmente é necessário incluir no modelo outros componentes do meio, tal como produto inibitório que acumula no meio em ordem para obter uma descrição adequada para a cinética celular. Controles externos são necessários para regular e manter constante alguns parâmetros ambientais tais como: pH, temperatura e concentração de oxigênio dissolvido. De outra forma é necessário uma descrição multicomponente do ambiente no modelo para representar adequadamente o intervalo desejado de comportamento cinético. Tecnologia das Fermentações Cinética de Utilização de Substrato, Formação de Produtos e Produção de Biomassa. Forma de Condução do Processo: Sistemas Descontínuo, Descontínuo Alimentado e Contínuo 2 02) É possível formular um modelo com todos os fenômenos envolvido, explique? Não, geralmente procura-se simplificar o modelo, pois a consideração de inúmeros fenômenos envolvidos pode ser complexa, mesmo porque a consideração de um modelo complexo requer um conhecimento bastante amplo do mecanismo celular e dos mecanismos de adaptação dos microorganismos. Mesmo a consideração de um meio multifásico muitas vezes requer conhecimento experimental de alguns parâmetros, o que muitas vezes não é possível. As dificuldades de formulação encontram restrições, principalmente na determinação experimental para dar suporte à formulação. 03) O que é um modelo não estruturado ? e estruturado. Qual é mais idealizado e por quê? Um modelo pode ser estruturado ou não estruturado, de acordo com o número de componentes utilizados na representação celular. Representações celulares que são multicomponentes são chamados estruturados, enquanto representações celulares por um componente único são não estruturados. O modelo mais idealizado é o modelo não estruturado, pois considera a célula como um componente único e neste caso não se tem uma visão do caminho de reações biológicas na célula. Quando se incorpora características do ciclo celular no modelo, a validade e a faixa de aplicações do modelo celular aumenta. 04) De acordo com o balanço material para o reator batelada, se você estivesse modelando o crescimento, qual parâmetro teria de ser estimado e de que forma você procederia? Para um biorreator batelada, o balanço para o crescimento celular pode ser expresso pela equação 01, onde V é o volume do biorreator. ( ) xr VVXdt d = (01) A velocidade de reação é proporcional ao numero de células presente ou quantidade de biomassa (X) Xr xx µ= (02) A velocidade específica de crescimento µ depende das fases de crescimento no biorreator, é um parâmetro a ser estimado para a equação 03. Considerando o crescimento na fase exponencial µ é constante X dt dX xµ= (03) Ou: [ ] dt/lnXd dt dX X 1 x ==µ (04) Integrando a equação desde uma concentração inicial de inoculo (Xo), conhecida, obtém-se 05. Através de um ajuste linear com os dados experimentais da fase exponencial, pelos mínimos quadrados pode-se obter o valor de µ t XlnXln xo µ+= (05) Com o valor estimado pode-se calcular qualquer valor de X para um determinado tempo de fermentação ( )lagx t-t 0eXX µ = (06) Tecnologia das Fermentações Cinética de Utilização de Substrato, Formação de Produtos e Produção de Biomassa. Forma de Condução do Processo: Sistemas Descontínuo, Descontínuo Alimentado e Contínuo 5 varia de uma forma hiperbólica. Uma relação entre a taxa específica de crescimento e um elemento essencial do meio foi proposto em 1942. A relação de Monod estabelece que: sK s s max + µ=µ (13) Aqui, µmax é a taxa máxima de crescimento alcançável quando s>>Ks e as concentrações de todos os componentes são inalteradas. Ks é a concentração de nutriente limitante na qual a velocidade específica de crescimento é metade do seu valor máximo, falando superficialmente, é a divisão entre o intervalo baixo de concentração, onde µ se torna fortemente dependente (linear) de s e intervalo alto de concentração onde µ se torna independente de s. Como mostrado na figura 2 os valores de Ks para o crescimento da E-coli em meios de glicose e tryptophan são 0,22x10-4M e 1,1ng/mL respectivamente. Conhecendo-se a bioquímica celular, sabe-se que a equação de Monod é uma grande simplificação, assim como em outras áreas da Engenharia, há equações simples que expressam interrelações embora os significados físicos dos parâmetros sejam desconhecidos ou mesmo não existam. Figura.2 Dependência da velocidade específica de crescimento limitante da E-coli (a) meio com glicose e (b) Meio com tryptofano (com permissão de Prenctice Hall, Inc, Englewood Cliffs, New Jérsei) A forma da equação de Monod caracteriza diferentes situações. Freqüentemente o valor de Ks é muito pequeno. Para s muito maior que KS, o que ocorre na maioria das situações. A equação pode ser compreendida como uma adequada descrição do desvio de µ, em relação a µmax quando a concentração de s torna-se pequena. Para s muito menor que KS,, o comportamento de µ, é finito para uma determinada concentração de finita de s. 07) Explique o fenômeno do “wash-out” (use o recurso gráfico e o modelo matemático para auxiliar na explicação) Quando a taxa de crescimento de uma população está relacionada de acordo com uma equação de Monod, conecções emergem entre as condições operacionais do reator, cinética microbial e parâmetros estequiométricos. Para mostrar este fato, escreve-se um balanço de massa em termos de substrato limitante acoplado ao balanço de massa celular uma vez que µ depende de s. No balanço de substrato faz-se uso do fator de rendimento Yxs consumida substrato de massa formada célula de massa Yxs = (14) Para entender e modelar a cinética populacional, neste caso emprega-se modelos estruturados, que consideram somente a massa celular ou concentração em número de células para caracterizar a biofase ou fase biótica. A taxa Tecnologia das Fermentações Cinética de Utilização de Substrato, Formação de Produtos e Produção de Biomassa. Forma de Condução do Processo: Sistemas Descontínuo, Descontínuo Alimentado e Contínuo 6 líquida de crescimento rx é freqüentemente considerada como µx onde x é a massa de células por unidade de volume e µ tem unidade do recíproco de tempo e é chamado de velocidade específica de crescimento das células. Usando esta forma de representação (crescimento balanceado) em um CSTR para o balanço de células, tem-se: ( ) 0r XXD dt dX xf =+−= (15) No estado estacionário é válido ( ) 0r XXD dt dX xf =+−= (16) Como não há células sendo alimentadas no sistema (alimentação estéril) Xf =0 0rDX x =− (17) Reescrevendo em termos de velocidade específica de crescimento XDX xµ= (18) Esta equação mostra que uma população diferente de zero é mantida dentro do reator, somente se a taxa de diluição for igual à velocidade específica. O balanço de massa para o substrato é escrito então por: ( ) 0x Y 1 ssD xs f =µ−− (19) Ou, substituindo µ, na equação anterior, tem-se: ( ) ( ) 0sK x s Y 1 ssD s max xs f =+ µ−− (20) Escrevendo um balanço celular no estado estacionário, tem-se: ( ) ( ) 0sK x s xxD s max f =+ µ−− (21) As equações 20 e 21 são o modelo quimiostato de Monod . Rearranjando: a equação 21, obtém-se 22 ( ) 0x DxDsK s f s max =+   −+ µ (22) Considerando que a alimentação xf é estéril, a concentração de substrato pode ser calculada como função da taxa de diluição. ( )D K D s max s −µ = (23) Para calcular a concentração de células, considerando-se alimentação estéril, recorre-se ao fator de conversão microorganismo/substrato (Yxs): ( ) ( )ss xx s x Y o f xs − − == ∆ ∆ (24) Isolando-se o valor da concentração celular e levando-se em conta que a concentração na alimentação é estéril, tem-se: ( ) xso Yssx −= (25) Tecnologia das Fermentações Cinética de Utilização de Substrato, Formação de Produtos e Produção de Biomassa. Forma de Condução do Processo: Sistemas Descontínuo, Descontínuo Alimentado e Contínuo 7 Substituindo-se o valor da concentração de substrato, eq. 23 na expressão anterior, tem-se: ( )   −µ−= D KD sYx max s fxs (26) As equações 23 e 26 contém a dependência explícita de x e s na taxa de diluição (D=F/V). Para fluxos pequenos a um dado volume, D tende a zero, então s tende a zero. Uma vez que todo substrato alimentado é consumido pelas células, a concentração de células no efluente é: fxssYx = Quando D aumenta continuamente, s aumenta inicialmente linearmente com D e então mais rapidamente quando D tende a µmax . A concentração celular x declina com o mesmo comportamento, primeiro linearmente em D, então diminuindo rapidamente quando D tende a µmax. Em algum ponto D se aproxima de µmax , x torna-se zero. A taxa de diluição simplesmente ultrapassou a máxima taxa possível de crescimento e o valor de estado estacionário para x é zero. Esta condição de perda de células no estado estacionário, chamado ¨wash-out¨ocorre para D maior que Dmax , onde x=0, neste caso a concentração de substrato no reator alcança o valor de entrada sf. fs fmax max sK s D + µ= (27) Figura 3 Dependência da concentração de substrato do efluente s , concentração celular x e produtividade celular xD, em relação à taxa de diluição D em cultura contínua (Modelo de Monod, µmax = 1 h-1; KS = 0,2 g/L; Yxs= 0,5; Sf= 10 g/L) Note que próximo ao ¨wash out ̈ o reator é muito sensível a pequenas variações em D; uma pequena variação em D fornece um relativo deslocamento em x e s. A sensitividade pode ser compreendida se a produção de massa celular é o objetivo do cultivo contínuo. A taxa de produção celular por unidade de volume de reator é Dx. Esta quantidade é ilustrada na figura 3 e aqui, s é máximo. Calcula-se o valor máximo de concentração de saída resolvendo a equação: ( ) 0 dD Dxd = (28) onde a equação 26 é usada para escrever x como função de D. Resolvendo a eq.28, fornece-se:     +−µ= fs s maxmax sK K 1D (29) Quando sf for muito maior que Ks que é o caso freqüente, o valor de Dmax, aproxima-se de µmax e conseqüentemente o ¨wash out ̈ se aproxima. Esta situação é evidente na figura 3, o que pode requerer uma desistência da obtenção da máxima produção de biomassa, para evitar a região de grande sensibilidade. Inclusões de Tecnologia das Fermentações Cinética de Utilização de Substrato, Formação de Produtos e Produção de Biomassa. Forma de Condução do Processo: Sistemas Descontínuo, Descontínuo Alimentado e Contínuo 10 Tais casos aparecem em fermentações do tipo I. A fermentação alcoólica é um exemplo desta classe. Tal cinética de formação de produtos são algumas vezes chamadas de crescimento associado. Em muitas fermentações, especialmente aquelas envolvendo metabólitos secundários, não ocorre significante formação de produtos em um pequeno tempo de processamento. A fermentação da penicilina exibe tal comportamento, neste caso o modelo cinético para representação é do tipo não associado. No caso não associado, a taxa de produção é proporcional à concentração celular (βx) ao invés da taxa de crescimento (αrx). O estudo clássico de Leudeking e Piret em fermentação do ácido acético por Lactobacillus delbrueckii é um exemplo de processo em que há uma contribuição cinética associada e não associada: xrr xp β+α= (38) Esta expressão envolvendo dois termos cinéticos, freqüentemente chamados de cinética Leudeking-Piret tem sido útil e versátil no ajuste de dados para a formação de produtos de diferentes fermentações. Esta é uma cinética esperada quando o produto é o resultado do metabolismo energético em fermentações anaeróbias. No caso do primeiro e segundo termos da equação 39 (após o sinal de igual), estes podem ser identificados como energia usada para o crescimento e manutenção, respectivamente. As figuras a seguir ilustram a classificação de produtos(metabólitos) microbianos de acordo com o crescimento (1)crescimento associado; (2) Crescimento misto; (3) Crescimento não associado). Metabólito primário: é aquele que é produzido durante a fase de crescimento exponencial do microrganismo. Um exemplo típico deste tipo de metabólito é a produção de álcool. O etanol é um produto do metabolismo anaeróbico de leveduras e algumas bactérias e é formado como parte do metabolismo energético. Uma vez que o crescimento só pode ocorrer se houver produção de energia, a produção de etanol está associada ao crescimento. Outros exemplos: aminoácidos, nucleotídeos, ácidos orgânicos e enzimas. Metabólito secundário: produzido durante a fase estacionária de crescimento ou idiofase, ou seja a produção “não associada” ao crescimento celular. Constituem o grupo mais comum e importante dos metabólitos de interesse industrial. Como exemplo clássico podemos citar a produção de antibióticos. Principais características dos metabólitos secundários: - cada tipo é formado por relativamente poucos m.o. - não são essenciais para o crescimento e reprodução celular - sua formação é extremamente dependente das condições de crescimento (meio) pois a repressão pode ocorrer - produzidos freqüentemente como um grupo de compostos estruturalmente relacionados - podem ser superproduzidos mais facilmente que os primários pois não são ligados ao crescimento. 14) Comente sobre modelagem de biorreatores: Processos fermentativos descontínuo, descontínuo alimentado, semicontínuo, continuos Processo fermentativo descontínuo: As fermentações descontínuas vêm sendo utilizadas há muitos anos, e nos dias de hoje ainda são muito empregadas em diversos processos fermentativos. Também conhecidas como fermentações em batelada, são constituídas de um reator, muitas vezes mencionado como dorna, que é carregado com microorganismos, sendo inoculada e incubada. No decorrer do processo fermentativo nada é adicionado, exceto oxigênio (processos aeróbios), antiespumante e ácidos ou bases. Uma das características básicas deste processo é a constância volumétrica, pois se admite não haver adições de soluções no processo e nem mesmo evaporação com perda de líquido. Consiste no preparo de inóculo e propagação em volumes maiores A técnica de preparação compreende duas fases distintas: a de laboratório e industrial. No laboratório se faz a inoculação de um pequeno volume de meio nutriente, incubado em condições favoráveis, transferindo-se para um volume maior e assim sucessivamente. O caso aplica-se até a fase industrial onde o volume necessário é obtido. Os cuidados dentro do processo variam conforme o objetivo do mesmo: Vale lembrar que as transferências devem ser efetuadas na fase logarítmica do processo. Tecnologia das Fermentações Cinética de Utilização de Substrato, Formação de Produtos e Produção de Biomassa. Forma de Condução do Processo: Sistemas Descontínuo, Descontínuo Alimentado e Contínuo 11 Os processos fermentativos descontínuos costumam ser classificados em três grandes grupos: 1. Cada dorna recebe um inóculo. 2. Processos com recirculação do microorganismo. 3. Processo por meio de cortes. A fermentação descontínua pode levar a baixos rendimentos e/ou produtividades, quando o substrato adicionado de uma só vez no início da fermentação, exerce efeitos de inibição, repressão ou desvia o metabolismo celular a produtos que não interessam. Apresenta também tempos mortos, períodos em que o fermentador não está sendo utilizado, como na carga e descarga. Entretanto possui algumas vantagens de bastante importância. Apresenta menos risco de contaminação, tem grande flexibilidade de operação, pode realizar fases sucessivas no mesmo recipiente, tem capacidade de identificar todos os materiais relacionados quando se está desenvolvendo um determinado lote de produto. Usada na indústria farmacêutica. Também de grande aplicação na indústria de alimentos, dentro da produção de diversos itens: iogurte, chucrute, cerveja, vinho entre outros. A velocidade específica de crescimentona fase esponencial também pode calcular a partir do tempo de duplicação celular, através da equação obtida substituindo-se a concentração final pelo dobro da inicial, na eq. 05 xx d 693.02ln t µµ == (39) Processo fermentativo descontínuo alimentado Este processo também é conhecido como batelada alimentada. Pode ser definido como uma técnica em que um ou mais nutrientes são adicionados ao fermentador durante o cultivo e em que os produtos permanecem aí até o final da fermentação. Algumas características importantes podem ser denotadas: A vazão de alimentação pode ser constante ou variar com o tempo. A adição do mosto pode ser de forma contínua ou intermitente. Pode haver ou não mudança de volume, pois depende da concentração de substrato e da taxa de evaporação. Cada condição de trabalho, pode levar a diferentes perfis de concentração de substrato, células e produtos. É interessante observar que ao contrário do sistema clássico descontínuo, neste caso podemos ter um perfil de concentração de microorganismos decrescente, pois a adição de mosto a dorna passa a ser um valor importante. Vale salientar que após o enchimento da dorna, o processo passa a ter características clássicas. A seguir observamos uma figura que ilustra o modo de operação de tal processo. Figura 4. Modo de operação processo descontínuo alimentado Devido à diversidade de aplicações que encontramos, algumas variações podem ocorrer para realizar ajustes e adequá-los a necessidade. Abaixo denotamos alguns deles e suas características principais: Processo descontínuo alimentado repetitivo – trata-se de retirar rapidamente um determinado volume de meio fermentado da dorna, sendo recomposto até seu valor máximo através da adição de mosto. Este processo tem por objetivo aproveitar como inóculo o microorganismo que está crescendo com alta velocidade de crescimento e trabalhar com células que estão na fase produtiva por mais tempo, respectivamente, levando ao aumento de produtividade do sistema. Este processo é utilizado para produção de leveduras e antibióticos. F mosto Inóculo Tecnologia das Fermentações Cinética de Utilização de Substrato, Formação de Produtos e Produção de Biomassa. Forma de Condução do Processo: Sistemas Descontínuo, Descontínuo Alimentado e Contínuo 12 Processo descontínuo alimentado estendido – tem por finalidade estender o período de fermentação, mantendo níveis de concentração de substrato no reator adequado para que as células continuem com atividade fermentativa direcionada para a formação do produto desejado. Além dessa classificação o processo também pode ser de duas formas: Controlada por mecanismo de retroalimentação:O fornecimento pode ser controlado como função da concentração deste no meio de fermentação, direto ou indireto como densidade otica, pH, etc Não controlado por sistema de retroalimentação: O substrato é fornecido ininterruptamente até o final da fase de enchimento da dorna. Abaixo descrevemos algumas finalidades do processo de fermentação descontinua alimentada: - Minimização dos efeitos de controle do metabolismo celular. A utilização deste processo é importante porque regula a concentração do meio, não propiciando uma superprodução de enzima ou produto que afete na eficiência do microorganismo, alterando por conseqüência sua sobrevivência. - Prevenção da inibição por substrato ou precursores. O controle de vazão na alimentação permite que se evite o trabalho em condições inibitórias, melhorando a produtividade e/ou rendimento desses processos fermentativos - Minimização da formação de produtos de metabolismo tóxico. O controle da velocidade de fornecimento de substrato ao sistema permite que se mantenha a velocidade de crescimento celular em intervalos desejados e/ou minimize a formação de produtos tóxicos para as células. - Superação de problemas freqüentes de estabilidade em processo contínuo - Para controlar problemas como: contaminação, mutação e instabilidade de plasmídeo. Em alguns casos o processo contínuo forma produtos indesejáveis, ou mesmo acarreta perdas por evaporação, então se utiliza o processo descontínuo alimentado que controla estes produtos formados (como a espuma na formação do etanol) e também repõe líquido perdido (como na produção de antibióticos). Processos semicontínuos O processo é semicontínuo, quando uma vez colocados no reator o meio de fermentação e o inóculo, as operações que se seguem obedecem à sequencia: Operação 1 – Aguarda-se o término da fermentação Operação 2 – Retira-se parte do meio fermentado, mantendo-se no reator o restante do meio fermentado Operação 3 – Adiciona-se ao reator um volume de meio de fermentação igual ao volume de meio fermentado retrado na operação 2 Um processo semicontínuo é assim considerado quando uma série de operações é realizada em seqüência. Primeiro aguarda-se o término da fermentação, depois se retira parte do meio fermentado, mantendo-se o restante no reator, adicionando ao reator um volume de meio de fermentação igual ao volume de meio fermentado. Pode-se dizer que o meio fermentado não retirado do reator serve de inóculo ao meio de fermentação adicionado. Classifica-se como semicontínuo porque tanto o fluxo de entrada do meio no reator quanto à saída de material fermentado são intermitentes. Nos interessa saber de que maneira a fração do volume retirado do fermentador interfere na produtividade do processo.