Apostila de farmacobotânica

Apostila de farmacobotânica

(Parte 1 de 2)

Apostila de Técnicas de microscopia vegetal

Profa . Fabiane Nepomuceno Costa

Diamantina – 2010

Apostila de Farmacobotânica

CONSIDERAÇÕES GERAIS As Ciências Morfológicas descrevem as relações espaciais dos elementos estruturais.

Esses elementos formam um sistema hierárquico, cujos componentes apresentam dimensões diferentes. De acordo com a estrutura que vai ser analisada, instrumentos diferentes são necessários para sua observação.

De um modo geral, órgãos vegetais são visíveis a olho nu ou com microscópio estereoscópico. Tecidos ou células são visualizados com microscópio óptico e organelas celulares com microscópio eletrônico.

Desse modo, o material botânico deve ser coletado e preparado adequadamente para uma boa observação.

COLETA Sempre que possível deve-se coletar um mínimo de exemplares de uma planta em seu estado mais perfeito e completo. A coleta deve ser adequada ao objetivo do trabalho a ser desenvolvido. Assim podemos ter a planta inteira ou partes como ramos, porções do caule etc.

CONSERVAÇÃO O material botânico pode ser conservado herborizado (prensado e desidratado) ou em líquidos de preservação, como etanol 70%, formaldeído a 10% ou FAA (formaldeído a 40%, ácido acético e etanol 95%).

Os líquidos de preservação podem ser fixadores, ou seja, substâncias químicas que promovem a morte das células e sua preservação estrutural em estado próximo do material fresco. Na fixação ocorre coagulação ou precipitação das proteínas ou de outros componentes celulares. As principais substâncias fixadoras são formol, álcool, iodo, bicromato de potássio e os ácidos: acético, pícrico crômico e ósmico. A escolha do uso de soluções depende dos objetivos do trabalho a ser realizado. Atenção para evitar o contato das soluções fixadoras com a pele, pois a maioria das substâncias citadas é tóxica.

O material fresco presta-se para observações rápidas ou que não dependem da conservação para verificação posterior.

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Ácido acético glacial5,0ml
Formaldeído10,0ml
Água destilada35,0ml

TIPOS DE PREPARAÇÕES Para se observar o material em microscopia óptica, este deve ser suficientemente delgado para que a luz possa passar através dele. A observação de algumas estruturas só é possível após o preparo destas, envolvendo seccionamento (cortes histológicos), diafanização ou dissociação (maceração) de órgãos ou tecidos.

Muitas vezes é aconselhável a coloração dos materiais, cuja finalidade é acentuar os contrastes entre os vários tipos de células e tecidos da planta. Os corantes ou reagentes mais largamente empregados são o cloreto de zinco iodado, Sudam I ou IV, Lugol, hematoxilina, verde-firme, azul de alcião, fucsina básica, orange G, entre outros.

1. Seccionamento (cortes histológicos)

É difícil interpretar estruturas tridimensionais pelo estudo de cortes delgados que podem fornecer uma falsa impressão da arquitetura do órgão. Por exemplo, uma simples fatia de um objeto como um ovo poderá dar a determinada pessoa que nunca tenha visto este objeto uma interpretação errada de sua estrutura. Assim, quando se estuda um órgão, é indispensável a utilização de cortes realizados em diferentes partes e em diferentes planos, ou então seriados.

Quando a estrutura ou órgão apresenta formato laminar achatado, os cortes podem ser: transversal (perpendicular ao maior eixo da estrutura), longitudinal (paralelo ao maior eixo da estrutura) ou paradérmico (paralelo à superfície plana e ao maior eixo da estrutura ou órgão) Figura 1). Em órgãos cilíndricos podem-se obter os seguintes tipos de cortes: transversal (perpendicular ao maior eixo da estrutura), longitudinal tangencial (paralelo ao maior eixo da estrutura ou órgão e que não passa pelo centro do mesmo) ou longitudinal radial (paralelo ao maior eixo da estrutura ou órgão, passando pelo centro do mesmo) (Figura 1).

Pode-se utilizar o micrótomo para obtenção de cortes finos, mas para realização dos cortes neste equipamento, o material vegetal deve estar devidamente desidratado e incluído em um suporte (mais comum: parafina). Geralmente obtêm-se cortes à mão livre, com auxílio de uma lâmina de barbear e/ou um suporte (isopor, pecíolo de embaúba, medula do caule de sabugueiro).

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Figura 1. Planos de corte em órgão cilíndrico.

2. Diafanização

A diafanização consiste em tratar amostras biológicas de modo a torná-las semitransparentes. É muito utilizada no estudo de venação, epidermes e estruturas reprodutoras.

3. Dissociação (maceração)

A dissociação ou maceração é o processo pelo qual há dissolução da substância intercelular (lamela média) separando-se, assim, as células que compõem o tecido. Há vários métodos para a se efetuar a dissociação de material vegetal.

PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS As preparações histológicas para microscopia óptica podem ser permanentes, semi- permanentes e temporárias.

Nas preparações temporárias utilizam-se cortes de material que são montados e no seu próprio líquido de inclusão ou no próprio corante ou reagente, que pode ser água, glicerina 50%, etanol 70% etc. As preparações temporárias podem ser coradas com cloreto de zinco iodado, Sudam I ou IV, lugol etc.

Transversal

Longitudinal radial

Longitudinal tangencial

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As preparações do tipo semi-permanente e permanente são aquelas que requerem um processo especial de preparação. Essas preparações têm a vantagem de se manterem em boas condições de observação por muitos anos e são montadas em gelatina glicerinada e bálsamo-docanadá, respectivamente. Corantes como safranina, hematoxilina, verde-firme, azul de alcião, fucsina básica e orange G são freqüentemente empregados.

TÉCNICA DE CORTES À MÃO LIVRE Por ser uma das maneiras mais simples, rápida e pouco dispendiosa, o procedimento de obtenção de cortes à mão livre é a metodologia que normalmente é escolhida para se iniciar um estudo em anatomia vegetal.

A técnica para seccionar um material vegetal à mão livre pode variar. Algumas regras básicas podem auxiliar o trabalho e devem ser seguidas: a. Verificar a orientação desejada pelo conhecimento prévio da morfologia do órgão em estudo, antes de cortar o material; b. Caso o material a ser cortado seja muito pequeno ou escorregadio e não possa ser mantido com firmeza entre os dedos da mão, recorremos a suportes (Figura 2); c. A superfície a ser cortada deverá ser igualada com uma lâmina de barbear antes de realizar os cortes; d. Colocar uma gota de água sobre o material e fazer o corte, segurando a lâmina de barbear entre os dedos polegar e indicador. Devem ser utilizadas lâminas de barbear novas, pois uma lâmina já usada impede a obtenção de um bom corte; e. Durante o corte, a lâmina de barbear deve deslizar suavemente sobre a superfície do material. Exercer pouca pressão. O suficiente para cortar e se obter cortes bem delgados; f. Deve-se fazer um grande número de cortes para posterior seleção dos mais delgados.

Estes são mais transparentes e dobram quando suspensos por um pincel ou estilete; g. Á medida que os cortes forem sendo feitos, transferi-los, com o auxílio de um pincel ou estilete, para uma placa de Petri ou vidro de relógio, contendo água ou qualquer outro líquido de inclusão; h. Colocar a placa de Petri sobre um fundo que permita visualizar melhor os cortes e selecionar os mais finos;

TÉCNICA DE CLAREAMENTO A célula vegetal contém inúmeras substâncias que possuem cor, dentre elas os pigmentos. Para facilitar a observação das estruturas, vários métodos de coloração podem ser

Apostila de Farmacobotânica empregados, entretanto para que sejam eficientes, é necessário que os tecidos estejam livres de outras cores.

O clareamento dos cortes é feito utilizando solução de hipoclorito de sódio comercial ou cloral hidratado. O transporte dos cortes mais delgados para a solução de hipoclorito deve ser feito com o auxílio de estilete e não com pincel, para não danificar suas cerdas. Transferir os cortes em seguida para outro recipiente com água destilada e enxaguar abundantemente. Com o objetivo de corrigir o pH para que não haja interferência na eficácia do corante, passar os cortes em solução de ácido acético diluído, enxaguando em água em seguida.

Uma dupla coloração simples e fácil de ser realizada é a que emprega como corantes o azul de alcião e a fucsina básica. a. Retirar os cortes do meio de fixação ou preservação, lavar com água destilada e colocar a solução de hipoclorito de sódio comercial, até que fiquem clarificados; b. Lavar várias vezes em água destilada; c. Gotejar azul de alcião 0,5% e deixar por 1 a 3 minutos; d. Lavar em água destilada; e. Gotejar fucsina básica 0,1% em etanol 50% e deixar por 1 minuto; f. Lavar em etanol 50% e depois em água destilada até o corante não ser mais eliminado; g. Colocar, com um conta gotas, uma gota de glicerina 50% sobre a lâmina histológica; h. Transferir para a lâmina, com o auxílio de um pincel, o corte a ser examinado; i. Cobrir com lamínula: encoste um dos lados da lamínula no bordo da gota de líquido de montagem e espere que este se espalhe ao longo da lamínula e, então, desça-a lentamente para evitar a formação de bolhas de ar; j. Se necessário, retirar o excesso do meio de montagem com papel de filtro; k. Algumas vezes é interessante manter a lâmina para observações posteriores. Para tanto deve-se vedar toda a lamínula com esmalte de unha incolor.

Reagentes: a. Cloreto de zinco iodado (Composição: Cloreto de zinco, iodeto de potássio, iodo e água destilada).

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É usado para detectar lignina (coloração amarelo-acastanhada) e celulose (coloração cinza-azulado). Os grãos de amido são corados em marrom ou azul-negro pela presença de iodo na composição do reagente. b. Floroglucina acidificada (Composição: etanol 95%, floroglucinol e ácido clorídrico 37%).

É usado para detectar lignina (coloração vermelha). c. Lugol (Composição: iodo, iodeto de potássio e água destilada). É usado para detectar grãos de amido (coloração marrom a azul-negra).

Corantes: a. Azul de alcião (Composição: azul de alcião, ácido tartárico e água).

É usado para detectar celulose (coloração azul). b. Fucsina básica (Composição: fucsina básica e etanol 50%).

É usado para detectar lignina (coloração vermelha). c. Sudam IV (Composição: Sudam IV, etanol 80% e glicerina).

É usado para detectar cutina e suberina (coloração marrom-avermelhada). d. Safranina (Composição: safranina e etanol 50%).

É usado para corar material dissociado e detectar lignina, suberina e cutina (coloração avermelhada).

Obs.: O corante que será mais utilizado em nossas aulas é o safrablau. Trata-se de uma solução composta por dois tipos de corantes: o azul de astra ou azul de alcião, que cora paredes celulósicas em azul, e a safranina, que cora paredes lignificadas, suberificadas e cutinizadas em vermelho.

DESENHOS As práticas de Anatomia Vegetal são realizadas mediante a observação de várias estruturas vegetais em diversos grupos, portanto é necessária a documentação das observações através da confecção de desenhos.

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