2º Relatório de Bioquímica - Determinação de Açúcares Redutores DNS

2º Relatório de Bioquímica - Determinação de Açúcares Redutores DNS

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1. INTRODUÇÃO

Com o crescente avanço tecnológico, encontra-se cada vez mais em indústrias novos equipamentos que dão resultados mais eficazes e em menor tempo. Os métodos instrumentais estão sendo expandidos para a escala industrial e abrangem as mais diversas análises nas inúmeras áreas de atuação na industria química.

Um exemplo disso são os métodos espectrofotométricos, como é o caso do método em estudo, “o método do DNS”. É um método rápido e prático na determinação de açúcares redutores, e tem grande aplicabilidade industrial.

No controle de qualidade envolve a caracterização das matérias primas para fins de processamento, e verificação se determinado produto está dentro dos parâmetros e padrões exigidos pela legislação. Na indústria açucareira, serve para controlar se o açúcar, a sacarose, quando hidrolisado sofreu processo de redução, que não é tão facilmente percebido no acompanhamento do processo. Também é utilizado no acompanhamento do processo de fermentação, que permite verificar as taxas de consumo de açúcar pelo microorganismo, necessário para a compreensão da cinética do processo.

2. OBJETIVOS

Construir a curva padrão de glicose, plotando absorbância x concentração e, através de regressão linear, determinar a equação da curva e o coeficiente de correlação.

Determinar também a concentração de açucares redutores numa amostra de concentração desconhecida.

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Os carboidratos, ou mais comumente, açúcares, abrangem um dos maiores grupos de compostos orgânicos conhecidos na natureza, e juntamente com as proteínas formam os principais constituintes dos organismos vivos, além de serem a mais abundante fonte de energia para o homem. São acetais ou cetais poliidroxilicos com a fórmula empírica (CH2O)n. Os carboidratos simples mais abundantes são as pentoses e hexoses. Os açúcares possuem um ou mais átomos assimétricos de carbono, portanto podem existir na forma de estereoisômeros. Já os açucares de ocorrência natural, por exemplo, glucose, frutose e manose, pertencem as séries D (forma de isomeria ótica).

Os carboidratos tem diversas classificações, de acordo com seu tamanho, de acordo com o grupo funcional que é derivado, entre outras. As classificações podem ser: monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.

Os monossacarídios são carboidratos simples que não podem ser hidrolisados a açucares de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialdeídos) e cetoses (poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o número de carbonos na cadeia.

Os oligossacarídios são polímeros compostos de resíduos de monossacrídios unidos por ligações hemiacetálicas, neste caso denominadas ligações glicosídicas, em número que variam de duas, até, aproximadamente, dez unidades. São compostos importantes na determinação de estruturas de polissacarídios.

Polissacarídios são macromoléculas facilmente encontradas na natureza e que ocorrem em quase todos organismos exercendo diversas funções. Formam-se a partir das ligações glicosídicas geralmente com mais de 10 unidades de monossacarídios ou seus derivados. As unidades monossacarídias mais decorrentes são: D-glucose, D-manose, D-frutoses, D e L-galactose, D-xilose e D-arabinose. O polissacarídios mais conhecido é o amido, que é um dos mais importantes constituintes dos alimentos.

Na indústria, bem como na natureza, existem diversas reações tanto de degradação como de formação desses açucares que são determinantes no controle de qualidade dos produtos produzidos.

Um açúcar redutor é um açúcar no qual o carbono carbonila (anomérico) não está envolvido em uma ligação glicosídica e, portanto, pode sofrer oxidação.

Os monossacarídeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais como os íons férrico e cúprico. O carbono do grupo carbonila é oxidado a ácido carboxílico (LENINGHER, 1995). Todos os monossacarídeos são potencialmente redutores, devido a presença da carbonila. Outros carboidratos necessitam ser hidrolisados para se tornarem redutores.

O método do DNS é um método onde ocorre a oxidação do grupo carbonila. O oxidante, chamado DNS utiliza o ácido dinitro-salicílico; sal de Rochelle, (solução de tártaro de sódio de potássio) que serve para prevenir o reagente da ação do oxigênio dissolvido; fenol, que é utilizado para aumentar a quantidade de cor produzida; bissulfito, que é um estabilizante da cor obtida na presença do fenol; hidróxido de sódio, que é o redutor da ação da glicose sobre o ácido dinitro-salicílico. Ocorre no método do DNS a seguinte reação de oxidação:

Figura 1: Reação de oxidação da carbonila pelo reagente DNS.

Ocorre neste caso a redução do 3,5-di-nitrosalicitato (de cor amarelo forte) ácido e a oxidação do monossacarídeo, a glicose, formando o 3-amino-5- nitro-salicilato (de cor laranja-marrom forte), na proporção estequiométrica.

Portanto, pela determinação da luz absorvida a 540nm pelo 3-amino-5- nitrosalicilato, pode-se determinar a concentração de açúcar redutor presente na solução.

Também para cada tipo de amostra deve se levantar uma curva padrão do açúcar em estudo, por exemplo, se a amostra analisada contém frutose, devemos fazer a curva padrão para a frutose, dentro de um determinado intervalo de concentração, e respeitando a Lei de Beer.

4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Materiais Utilizados:

 Tubos de ensaio;  Pipetas graduadas de 1mL e 10mL;

 Pipeta volumétrica de 1mL;

 Pipetador;

 Água destilada;

 Solução padrão de glicose;

 Reagente DNS;

 Banho Maria;

 Estante para tubos de ensaio;

 Becker;

 Espectrofotômetro.

4.2 Metodologia: Preparo da Curva Padrão:

 Separou-se 5 tubos de ensaio, numerando-os de acordo com as diluições;

 Adicionou-se a cada tubo a amostra de glicose padrão visando as seguintes concentrações: 1g/L, 0,8g/L, 0,6g/L, 0,4g/L e 0,2g/L, ou seja, adicionou-se 1mL, 0,8mL, 0,6mL, 0,4mL e 0,2 mL de amostra padrão de glicose;

 Completou-se o volume dos tubos, com H2O, a 1mL: 0mL no 1º tubo; 0,2mL no 2º; 0,4mL no 3º; 0,6mL no 4º e 0,8mL no último;

 Adicionou-se em seguida 0,5mL do reagente DNS em cada tubo de ensaio;

 Levou-se os 5 tubos ao banho Maria durante 5 minutos e a temperatura de 100ºC;

 Após o tempo decorrido, interrompeu-se a reação colocando os tubos num banho de água fria;

 Adicionou-se a cada tubo 8,5mL de água destilada para elevar o volume a 10mL;

 Levou-se os tubos ao espectrofotômetro, e leu se os valores em %Transmitância, no comprimento de onda de 540nm (λ=540nm) devidamente calibrado o espectro e com o auxilio de uma cubeta;

 Construiu-se a curva com o auxilio do Excel.

Preparo do Branco e da Amostra:

Branco:

Utilizou-se 1mL de água como amostra em lugar da solução de glicose e adicionou-se 0,5mL do reagente DNS e levou-se ao banho Maria juntamente com os tubos da curva padrão, e em seguida também foi resfriada em água fria e elevado seu volume com água destilada a 10mL.

Amostra Desconhecida:

Utilizou-se 1mL de amostra convenientemente diluída, e adicionou-se 0,5mL do reagente DNS e levou-se ao banho Maria juntamente com os tubos da curva padrão, e em seguida também foi resfriada em água fria e elevado seu volume com água destilada a 10mL.

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Curva padrão de glicose:

Na tabela 1 abaixo estão listados os dados obtidos durante a prática:

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