6º Relatório de Bioquímica - Análise Qualitativa de Algumas Enzimas

6º Relatório de Bioquímica - Análise Qualitativa de Algumas Enzimas

1. INTRODUÇÃO

As enzimas desempenham um papel fundamental no organismo vivo, já que catalisam reações bioquímicas de desenvolvimento e manutenção das células.

Medindo-se a velocidade da reação catalisada por uma enzima, determina-se sua concentração. Para isso, é necessário utilizar métodos analíticos que permitam medir a diminuição na concentração do substrato ou o aumento na concentração do produto da reação.

Diversos fatores podem influenciar na atividade enzimática, como a concentração do substrato, temperatura, pH, concentração de ativadores e inibidores, concentração do produto. Estas variáveis devem ser controladas. Às vezes, a presença de ativadores e inibidores em sistemas biológicos não pode ser detectada, e por isso não podem ser controlada. Em vista disso, a medida da atividade enzimática não corresponde respectivamente à concentração real da enzima. Deve-se manter a constante durante o experimento, a fim de se medir com precisão a velocidade de uma reação enzimática.

Enzimas são biocatalisadores utilizados em diferentes aplicações. Dentre os principais setores de aplicações estão os alimentos, papel e celulose, a produção de bicombustíveis, detergentes e as atividades que envolvem tratamento enzimático de produtos agrícolas. Já, para enzimas especiais tem aplicações em fármacos, reações para diagnostico alem de inúmeras linhas em pesquisa básica.

Em análises clínicas, freqüentemente utilizam-se enzimas no diagnóstico de doenças. Na indústria farmacêutica, enzimas ligadas a matrizes insolúveis (enzimas imobilizadas) são usadas como reatores químicos altamente específicos. A - galactosidase é utilizada para reduzir o conteúdo de lactose no leite, por exemplo.

Além disso, enzimas são utilizadas como reagentes químicos em analisadores clínicos portáteis. Dosagens de colesterol, triacilgliceróis, glicose, podem ser realizadas em poucos minutos, usando plasma. Anticorpos específicos contra um antígeno protéico são acoplados a uma enzima indicadora, como peroxidase de raiz forte (horseradish), gerando um ensaio muito específico e sensível.

2. OBJETIVOS

Demonstrar e identificar a presença e a atividade de algumas enzimas existentes em produtos naturais, através de identificações por reações específicas, em testes qualitativos.

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

As enzimas são proteínas que, atuam como catalisadoras na maioria das reações bioquímicas. Os catalisadores aceleram as reações químicas, até torná-las quase instantâneas, pois baixam a energia de ativação necessária para que a reação ocorra.

A grande maioria das reações bioquímicas se dá em vias metabólicas, que são seqüências de reações em que o produto de uma reação é utilizado como reagente na reação seguinte. Diferentes enzimas catalisam diferentes passos de vias metabólicas, agindo de forma concertada, assim não interrompendo o fluxo nessas vias. Por outro lado, cada enzima pode sofrer ajuste da sua atividade, aumentando, diminuindo ou mesmo interrompendo. Assim, o fluxo de uma via metabólica depende da velocidade de catálise das enzimas que nela participam. Um pequeno grupo de enzimas, as ribozimas, têm uma natureza não protéica. As ribozimas são moléculas de RNA que possuem capacidade catalítica.

Uma das propriedades das enzimas, como catalisadores, é que elas não alteram o equilíbrio de uma reação. Em geral, uma enzima catalisa apenas um substrato, algo que é condicionado pela estrutura do centro ativo da enzima. Este possui uma geometria definida e determinadas características físico-químicas que condicionam o tipo de substrato que pode se ligar e sofrer alteração química no centro ativo.

Quando um substrato se liga ao centro ativo, forma-se o chamado complexo enzima-substrato (ES). A formação do ES é importante na determinação da velocidade de reação e, por conseqüência, na velocidade de formação dos produtos. O substrato sofre uma alteração enquanto se encontra ligado à enzima, transformando-se num produto; existe então, de forma transiente, um complexo enzima-produto (EP). O produto se desliga então da enzima, e esta encontra-se preparada para novo ciclo catalítico.

A determinação da atividade enzimática envolve a medida da velocidade da reação. Pode ser medida com a enzima pura e em condições tais que permita que a velocidade da reação seja máxima, o que significa que o substrato (S) deve estar em concentração elevada, de modo a permitir que toda enzima (E) esteja transformada nesse complexo ativado enzima-substrato (ES). Nesse caso a velocidade (V) da reação é proporcional a concentração enzimática, e também ao complexo ES.

A velocidade das reações enzimáticas varia com fatores de concentração de enzima e substrato, bem como temperatura e pH.

As enzimas podem ser classificadas de acordo com o tipo de reação em que atuam. As chamadas oxidorredutases catalisam reações de oxi-redução em sistemas biológicos e estão relacionadas com processos de respiração e fermentação. Podemos citar como membros deste grupo: hidrogenases, oxidases, peroxidases, hidroxilases e oxigenases. As transferases são enzimas que catalisam a transferencia de grupos de um composto para outro, como por exemplo, a metilação em sistemas biológicos. As hidrolases catalisam reações hidrolíticas, estando entre elas as enzimas proteolíticas e as amilolíticas. As liases atuam nas reações de eliminação, elas modificam o substrato cindindo compostos ou removendo grupos da molécula de substrato, dando lugar a formação de uma dupla ligação, como por exemplo as descarboxilases. As isomerases são enzimas que catalisam reações de isomerização. As ligases (sintetases) são enzimas que atuam na reação de sintese de novos compostos, nas quais duas moléculas são ligadas as custas da energia liberada na degradação da molécula de ATP.

A urease é uma importante enzima relacionada à decomposição microbiana de compostos orgânicos. Ela é considerada uma enzima constitutiva, pois é sintetizada pela bactéria na presença ou ausência do substrato (uréia). Pode ser encontrada em bactérias, leveduras e várias plantas superiores. A urease é um enzima que catalisa a hidrólise da uréia em dióxido de carbono e amônia. A reação processada é a seguinte:

A catalase é uma enzima constitutiva importante, que apresenta a função biológica de proteger as células das substancias tóxicas produzidas pela atividade do oxigênio sobre a superfície celular. É uma enzima intracelular, encontrada na maioria dos organismos, que decompõe o peróxido de hidrogênio, segundo a reação química:

2 H2O2 → 2 H2O + O2

4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Materiais Utilizados:

Tubos de ensaio; Pipetas graduadas de 10 mL;

Solução de uréia 3% em tampão fosfato pH 7;

Pipetador;

Água destilada;

Vermelho de fenol;

Farelo cru;

Farelo tostado;

Suspensão de batata em tampão fosfato pH 7;

Banho maria a 30°C;

Estante para tubos de ensaio;

Água Oxigenada 0,1 M.

4.2 Método:

1. Urease

Em tubos de ensaio com tampa, contendo um grama de farelo de soja cru em um tubo e um grama de farelo de soja tostado no outro tubo, adicionar 4 mL da solução de uréia nos dois tubos. Deixar de repouso por 30 minutos a 30°C e após adicionar gotas do indicador vermelho de fenol. Fazer um branco com adição apenas do tampão

2. Catalase

Em um tubo de ensaio adicionar 5 mL da suspensão enzimática de batata e após adicionar 10 mL de água oxigenada 0,1 M.

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

1. Urease

As cores observadas nos três tubos de ensaio foram:

Tubo de ensaio com o tampão: vermelho (cor do indicador); Tubo de ensaio com o farelo cru: rosa intenso; Tubo de ensaio com o farelo tostado: vermelho.

Observando as cores, podemos perceber que no tudo de ensaio que contém o farelo cru possui atividade enzimática, pois a cor do rosa intenso é devido à amônia formada, pois a urease está presente no farelo cru e está decompõe a uréia em amônia, segundo a reação abaixo:

Já observando o tudo de ensaio que continha o farelo de soja tostado obteve a mesma cor do tampão, pois não há atividade enzimática no farelo, ou seja, a enzima urease presente no farelo de soja foi desativada, não decompondo assim a uréia em amônia.

2. Catalase

Observou-se que quando adicionado a água oxigenada na suspensão de batata ocorreu um rápido desprendimento de O2 devido à presença da enzima catalase na suspensão de batata, isto ocorre seguindo a reação abaixo:

6. CONCLUSÃO

Pode-se observar nesta prática a ação e a presença das enzimas nos alimentos. Podemos ver que no teste da urease a ação desta enzima e podemos concluir também que o farelo de soja foi corretamente tostado, pois a urease foi desativada e não houve ação enzimática sobre a uréia, quando esta adicionada no tubo de ensaio.

Já no teste da catalase pode-se perceber o rápido desprendimento do oxigênio, o que indicou a presença da enzima em estudo e a sua rápida ação sobre a água oxigenada.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

LEHNINGER, Albert L. Bioquímica; São Paulo: Editora Edgard Blucher LTDA,1976 ;

REGULY, J. CIntrodução à Analítica e a Tecnologia de Carboidratos, Lipídios,

Proteínas e Enzimas . Rio Grande: Editora da FURG, 1983.

Bioquímica/Enzimas. Disponível em: < http://pt.wikibooks.org/wiki/Bioqu%C3%ADmica/Enzimas> Acesso em 09 de Junho de 2010;

Enzimas, Aspectos Gerais. Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos. Disponível em: < http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/lista_exerc/enzimas_aspectos_ger ais.pdf> Acesso em 09 de Junho de 2010;

Disciplina de Bioquímica Industrial Professor André Burkert

Análise Qualitativa de Algumas Enzimas

Ana Carolina Butzke – 40726 Caroline Lindemann – 40755 Thiago Carvalho – 41400 Vanessa Wendt Schmidt – 40748

Rio Grande, Junho de 2010

1. Qual a importância e exemplos de aplicação prática das enzimas mencionadas acima?

As enzimas desempenham um papel fundamental no organismo vivo, já que catalisam reações bioquímicas de desenvolvimento e manutenção das células.

A catalase é usada na indústria têxtil para a remoção de peróxido de hidrogênio de tecidos. Encontra-se também em alguns produtos de limpeza de lentes de contacto, agindo como agente antibacteriano. Encontrada na maioria dos organismos, a catalase decompõe o peróxido de hidrogênio, que é tóxico para as células, em espécies química que sejam inócuas.

A urease é a enzima que catalisa a hidrólise da uréia para dióxido de carbono e amônio, sendo produzida por um grande número de microrganismos principalmente bactérias. A distribuição da urease e os fatores que a influenciam tem importância relevante em vista do uso da uréia na agricultura como fertilizante e um dos fatores que podem influenciar a atividade desta enzima no solo é o uso crescente de pesticidas.

2. A partir do teste qualitativo de urease como poderia ser elaborado um método quantitativo de determinação da atividade enzimática da referida enzima?

A análise quantitativa da enzima poderia ser feita da seguinte maneira:

Ensaios diretos: medida direta da concentração do substrato ou produto em função do tempo.

Ensaios indiretos: quando a medida da concentração do substrato e do produto são próximas, a geração do produto pode ser acoplada a outra reação não enzimática, que produza um sinal mais conveniente.

Ensaios acoplados: a reação enzimática de interesse é acoplada a uma segunda reação enzimática, que pode ser convenientemente medida, tendo como exemplo a reação da glicose oxidase

Para a obtenção de uma análise quantitativa é necessário saber:

‐ Toda estequiometria de uma reação catalítica ‐ Se a enzima requer adição de cofatores como um íon ou coenzima;

‐ A dependência da enzima sob a concentração do cofator ou substrato. ‐ O pH ótimo.

‐ A temperatura pela qual a enzima esta estável e apresenta alta atividade.

‐ O procedimento para determinação do aparecimento e desaparecimento do produto de reação ou substrato, respectivamente, ou de um intermediário (especialmente quando estes são coloridos ou absorvidos em luz UV).

A análise quantitativa é confirmada quando o substrato ou o produto é colorido ou absorvido em luz ultravioleta. O valor de aparecimento ou desaparecimento do produto ou substrato absorvido por luz pode ser analisado pelo espectrofotômetro. Além do produto ou substrato pode - se analisar o intermediário (aquele que serve como ponte para o desencadeamento de outra reação).

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