Coloração de Gram-com figuras

Coloração de Gram-com figuras

UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA QUÍMICA

DISCIPLINA :MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

PRÁTICA

MÉTODOS DE COLORAÇÃO

Baseia-se na diferença de composição química e espessura das paredes bacterianas de que depende a permeabilidade ao álcool e à acetona e, em conseqüência, a dissolução mais ou menos rápida de complexos corados formados no citoplasma.

Esta coloração permite dividir as bactérias em dois grandes grupos: as bactérias gram (+) e as gram (-).

A coloração de gram depende não só da técnica, dos microrganismos como também da idade da cultura bacteriana. Assim a positividade ao gram enfraquece com o envelhecimento.

1. OBJETIVOS:

  1. Observar formas e estruturas bacterianas mediante o emprego de técnicas de coloração simples e diferenciais;

  2. Discutir as interpretações possíveis do mecanismo de ação da coloração de gram;

  3. Avaliar a importância taxonômica dos métodos de coloração em microbiologia.

2. FUNDAMENTO TEÓRICO:

Uma das principais características da célula bacteriana diz respeito a sua morfologia (forma, tamanho, arranjo e estrutura). A observação destas características ao microscópio tem exigido constantemente o emprego de técnicas de coloração no sentido de relevar uma expressiva gama de detalhes.

Muitas vezes, o exame de preparações microscópicas não coradas de microrganismos vivos, simplesmente em água sobre uma lamina, só permite suspensos em água sobre uma lâmina, só permite a visualização de arranjos das células e motilidade, se a espécie em questão o for.

As bactérias têm afinidades por um grande número de corantes, em particular os derivados básicos de anilina (azul de metileno, violeta de genciana, fucsina básica, etc.).

Estudando o comportamento das bactérias em relação a certos corantes, comprovou-se, empiricamente, a existência de reações de soluções corantes características para determinados grupos bacterianos. Dentre os métodos de coloração diferencial, o de Gram (CHRISTIAN GRAM, 1884) é o mais usado na bacteriologia, sendo indispensável na identificação de organismos.

É sabido que uma série de fatores influenciam os resultados da coloração de gram, entre eles podemos citar: densidade celular de esfregaço, concentração do corante, natureza e tempo de uso do agente descorante. Para obtenção de resultados consistentes é importante uniformizar tais variáveis.

O método de gram se baseia no fato de que, quando certas bactérias são coradas pelo Cristal Violeta e depois tratadas pelo Lugol, forma-se um composto de coloração escura (roxo-violeta) entre o iodo e o cristal violeta, o qual é fortemente retido por certas bactérias e não pode ser removido pelo tratamento subseqüente com o álcool. Tais bactérias são ditas gram-positivas (gram+). Outras bactérias deixam-se descorar facilmente pelo álcool e são classificadas como gram-negativa(gram-). Após tratamento pelo álcool usamos um contra corante (fucsina ou safranina) e observamos que as bactérias (gram-) tem a cor vermelha, ao passo que as (gram+) tem a cor roxo-violeta.

Preparações:

  • Soluções

  1. Cristal violeta 2% com oxalato de amônio

Solução A: Cristal violeta.................................................... 2g

Álcool etílico (96%)......................................... 20 ml

Solução B: Oxalato de amônio............................................ 0,8 g

Água destilada.................................................. 80 ml

* Misturar as soluções A e B.

  1. Lugol

Iodo cristalizado............................................................. 1g

Iodeto de potássio........................................................... 2g

Água destilada................................................................. 300 ml

  1. Safranina (0,25%)

Safranina (2,5% em álcool a 96%)................................. 10 ml

Água destilada................................................................. 100 ml

Safranina (2%)

Safranina.......................................................................... 2g

Água destilada................................................................. 100 ml

    • Preparo do esfregaço

Põe-se uma gota de água destilada sobre uma lamina e com uma alça de platina retira-se um pouco do crescimento da superfície dos meios sólidos. O material é espalhado sobre a lâmina, numa pequena área, deixado secar.

A fixação do esfregaço à lâmina é realizada passando a lâmina por 3 vezes através da chama do bico de Bunsen.

Métodos de evidenciação e coloração

    • Exame do material a fresco, entre lâmina e lamínula

Técnica:

- Colocar, com auxílio de uma alça de platina, previamente flambada, uma gota de cultura líquida numa lâmina desengordurada e seca.

- Cobrir com uma lamínula, evitando a formação de bolhas de ar, e examinar ao microscópio, usando a objetiva de imersão.

    • Coloração de gram

Técnica:

- Fazer um esfregaço fino;

- Cobrir com Cristal Violeta por 1 min;

- Lavar com água corrente;

- Cobrir o esfregaço com Lunol por 1 min;

- Descorar com álcool a 95%;

- Lavar com água corrente;

- Contra-corar com safranina ou fucsina por 20 seg;

- lavar com água corrente e secar entre duas folhas de lenço de papel absorvente;

- Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

Resultados:

    • Microrganismos (Gram+): azuis ou violetas

    • Microrganismos (Gram-): vermelhos

Material:

    • Microrganismos:

- Escherichia coli

- Staphylococcus aureus

    • Corantes e Reagentes:

- Cristal Violeta

- Lugol

- Safranina ou Fucsina

- Álcool Etílico

    • Equipamentos:

- Microscópio

- Bico de Busen

    • Diversos:

- Alça e agulha de platina

- Pinça

- Lenços de papel absorvente

- Óleo de imersão

- Xilol

3. QUESTÕES:

  1. Anote os resultados:

- Forma

- Arranjo

- Gram

  1. Os meios de cultivo e a idade da colônia exercem alguma influencia na morfologia das células?

  2. Qual o papel da parede celular bacteriana na Coloração de gram?

PREPARO DAS SUBSTANCIAS UTILIZADAS NA COLORAÇÃO DE GRAM

CRISTAL VIOLETA

LUGOL

SAFRANINA

ETANOL

Cloud

ESQUEMA

PROCEDIMENTOS PARA COLORAÇÃO DE GRAM

PREPARO DO ESFREGAÇO PARA COLORAÇÃO DE GRAM

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