Cinética de reações enzimáticas

Cinética de reações enzimáticas

Universidade Federal de Santa Catarina

Centro de Ciências Físicas e Matemáticas

Departamento de Química

Disciplina de Físico-Química

Relatório da aula prática de Físico-Química:

“Cinética de reações enzimáticas”

Rodrigo Ivan Prim

Bernardo Della Giustina

Mônica Alves Aguiar

Sandro Wopereis

Eros Olímpio

Florianópolis, 02 de junho de 2007.

Resumo

É necessário que as reações químicas que ocorrem em nosso metabolismo sejam rápidas. Porém, para isto, é preciso que haja um catalisador atuando sobre elas. Estes catalisadores biológicos são proteínas com alta especificidade, as enzimas. Elas atuam baixando a energia de ativação da reação, fazendo com que a sua velocidade aumente de 107 a 108 vezes, mas não interferindo no processo.

A cinética de reações enzimáticas pode ser determinada de duas formas, medindo a velocidade do consumo do substrato ou a velocidade da formação do produto. Para ambas as formas, usa-se a equação da variação do reagente analisado sobre o tempo da reação. Na determinação pelo desaparecimento do substrato é adicionado o sinal negativo para indicar que ele está sendo consumido.

Medindo a velocidade inicial (V0) de uma reação simples, quando esta é catalisada por uma dada concentração de enzima ([S]) sob condições constantes de reação, verifica-se que a V0 varia de acordo com [S]. Em baixas concentrações, esta variação é proporcional, porém, em concentrações altas, V0 tende a um valor máximo, independendo de [S]. Matematicamente, podemos explicar isto através da equação de Michaelis-Menten (equação 1).

V0 = Vmax [S] (equação 1)

[S] + Km

O experimento se resume na determinação da velocidade inicial através da formação do produto. O catecol é convertido em quinona, reação esta catalisada pela enzima polifenoloxidase (oxirredutase). Foram realizadas leituras de 10 em 10 segundos até 600 segundos (10 minutos) para quatro concentrações de catecol diferentes.

Também serão realizadas algumas leituras de absorbâncias em comprimentos de onda diferentes para observar em qual deles aproximadamente ocorre o pico de absorbância.

Dados Obtidos

A primeira parte do experimento consistiu na determinação de V0 para as concentrações de catecol em 0,000833; 0,00125; 0,00167; 0,0025mol/L (conforme segue em cálculos) de 10 em 10 segundos até completar 600 segundos. Os dados resultantes seguem na tabela 1.

Tabela 1: Dados obtidos na primeira parte do experimento

Tempo (em s)

Absorbância

[]=0,000833mol/L

[]=0,00125mol/L

[]=0,00167mol/L

[]=0,0025mol/L

0

0,086

0,066

0,103

0,120

10

0,096

0,086

0,124

0,143

20

0,107

0,114

0,140

0,166

30

0,118

0,139

0,151

0,187

40

0,128

0,164

0,163

0,208

50

0,139

0,19

0,175

0,229

60

0,149

0,213

0,185

0,248

70

0,160

0,238

0,195

0,268

80

0,170

0,260

0,205

0,287

90

0,181

0,271

0,215

0,305

100

0,192

0,302

0,224

0,324

110

0,202

0,323

0,233

0,342

120

0,212

0,344

0,242

0,36

130

0,222

0,363

0,250

0,377

140

0,232

0,381

0,258

0,394

150

0,242

0,399

0,266

0,411

160

0,252

0,417

0,275

0,428

170

0,261

0,434

0,282

0,443

180

0,270

0,451

0,29

0,459

190

0,279

0,466

0,298

0,474

200

0,288

0,481

0,305

0,49

210

0,298

0,496

0,312

0,505

220

0,306

0,511

0,319

0,509

230

0,315

0,526

0,326

0,533

240

0,323

0,539

0,333

0,546

250

0,331

0,552

0,34

0,56

260

0,339

0,565

0,347

0,573

270

0,347

0,578

0,354

0,585

280

0,355

0,590

0,360

0,598

290

0,362

0,614

0,367

0,610

300

0,370

0,626

0,374

0,623

310

0,377

0,637

0,380

0,635

320

0,384

0,647

0,386

0,6460,657

330

0,391

0,658

0,392

0,6680

340

0,398

0,668

0,398

0,

350

0,405

0,679

0,404

0,680

Continuação da Tabela 1: Dados obtidos na primeira parte do experimento.

360

0,412

0,688

0,409

0,690

370

0,418

0,699

0,415

0,701

380

0,425

0,708

0,421

0,711

390

0,431

0,717

0,426

0,721

400

0,437

0,727

0,432

0,731

410

0,444

0,735

0,437

0,741

420

0,449

0,744

0,443

0,751

430

0,455

0,753

0,447

0,760

440

0,460

0,761

0,452

0,770

450

0,466

0,769

0,457

0,779

460

0,472

0,777

0,462

0,788

470

0,477

0,784

0,467

0,796

480

0,482

0,792

0,472

0,804

490

0,488

0,800

0,477

0,813

500

0,493

0,808

0,482

0,821

510

0,498

0,815

0,487

0,829

520

0,503

0,822

0,491

0,837

530

0,508

0,829

0,496

0,845

540

0,513

0,835

0,500

0,852

550

0,518

0,842

0,505

0,858

560

0,523

0,849

0,509

0,866

570

0,527

0,855

0,513

0,872

580

0,532

0,862

0,518

0,880

590

0,536

0,868

0,522

0,886

600

0,541

0,874

0,526

0,893

Já na segunda parte, foi realizada uma varredura em comprimento de onda de 400 à 530 nm. Porém, esta varredura foi feita lendo as absorbâncias em comprimentos de onda de 10 em 10 nm. Os dados experimentais constam na tabela 2.

Tabela 2: Dados obtidos na segunda parte do experimento.

Comprimento de onda (em nm)

Absorbância

400

0,822

410

0,696

420

0,581

430

0,515

440

0,541

450

0,607

460

0,613

470

0,519

480

0,425

490

0,327

500

0,271

510

0,240

520

0,236

530

0,270

Tratamento de Dados

O tópico “cálculos” corresponde ao tratamento de dados:

1. Calcule as concentrações finais de catecol usadas na experiência, ou seja, a concentração final dentro da cubeta. Use estas concentrações nos cálculos.

a) 0,5ml*0,005mol/L = 3,0mL*M

M = 0,000833mol/L

b) 0,75*0,005 = 3,0*M

M = 0,00125mol/L

c) 1,0*0,005 = 3,0*M

M = 0,00167mol/L

d) 1,5*0,005 = 3,0*M

M = 0,0025mol/L

2. Calcule a velocidade inicial (V0, coeficiente angular) para todas as cinéticas realizadas fazendo um gráfico de absorbância versus tempo.

O gráfico segue em anexo no final do relatório.

V0 = ΔA/Δt;

Para []=0,000833 M

V0 = 0,234/230

V0 = 0,0010 U.A. s-1

Para []=0,00125 M

V0 = 0,317/160

V0 = 0,0020 U.A. s-1

Para []=0,00167 M

V0 = 0,223/208

V0 = 0,0011 U.A. s-1

Para []=0,0025 M

V0 = 0,229/156

V0 = 0,0019 U.A. s-1

Obs.: Como a velocidade da reação com o catecol na concentração de 0,00167M se encontrou muito fora da curva média traçada, este ponto foi excluído dos cálculos.

3. Calcule Km e Vmax para a enzima, como mostrado na fig 2.

O gráfico segue em anexo.

O valor para -1/Km extrapolado no gráfico foi de -320, então:

Km = -1/-320; Km = 0,003125 M

O valor para 1/Vmax extrapolado no gráfico foi de 185, logo:

Vmax = 1/185; Vmax = 0,0054 U.A. s-1.

4. Faça um gráfico com os valores obtidos no item 7, absorbância versus comprimento de onda. (baseado no espectro, justifique porque as cinéticas foram acompanhadas em 458nm).

As cinéticas foram acompanhadas em 458 nm, pois este é o comprimento de onda em que há a maior absorbância. Em uma varredura, dizemos que é o pico de absorbância. O gráfico segue em anexo e nele pode-se visualizar melhor. Foi desenhado nele, próximo ao pico e em linha tracejada, o provável comportamento do gráfico se fossem medidas as absorbâncias em comprimento de onda de 1 em 1 nm.

Discussão de resultados

Pelos gráficos absorbâncias versus tempos podemos observar que a absorbância varia de acordo com o tempo, sendo que é diretamente proporcional nos primeiros segundos até aproximadamente 1 minuto (60 segundos) tendendo a se manter constante em tempos mais altos.

Como já dito anteriormente, a cinética com concentração de catecol 0,00167M foi excluída dos cálculos por apresentar-se errônea, pois seu valor se encontrou muito baixo em relação ao anterior e posterior (cinéticas das concentrações de 0,00125 e 0,00250M).

Pelos outros resultados é possível observar que a cinética enzimática de uma reação depende da concentração, sendo diretamente proporcional a esta nos primeiros valores, e tendendo a manter-se constante conforme aumentamos a concentração.

Questionário

1. Como podem ser definidas as enzimas? O que é substrato?

Enzimas são catalisadores biológicos são proteínas com alta especificidade. Elas atuam baixando a energia de ativação da reação, fazendo com que a sua velocidade aumente de 107 a 108 vezes, mas não interferindo no processo. Substrato e a reagente da enzima, o alvo que será catalisado.

2. Que fatores podem explicar a alta eficiência das enzimas como catalisadores?

Uma das explicações para a alta eficiência da enzima e com o complexo enzima substrato apresenta uma conformação bem próxima do estado de transição da reação, reduzindo desta forma a energia de ativação da reação

3. Qual a definição e significado de Km e Vmax na reação enzimática?

Vmax é a velocidade máxima da enzima, este valor não pode ser superado pois neste estado, a enzima já esta com todos os seus sítios ocupados. Para aumentar a velocidade da enzima a partir dai, so aumentando seu numero.

Km e o valor da concentração que corresponde a metade de Vmax no gráfico concentração do substrato versus velocidade da catalise. Ele indica a afinidade da enzima pelo substrato. Quanto menor o Km, maior e a afinidade entre os dois.

4. O que e inibidor enzimático, quais os tipos de inibição e os principais fatores que diminuem a atividade de uma enzima e substrato constantes. Explique.

Inibidores ou xenobióticos são substancias que, como o próprio nome retrata, inibem a atividade da enzima, ou seja, diminuem suas funções.

Existem dois tipos de inibidores, os irreversíveis e os reversíveis. Os irreversíveis ligam-se a enzima irreversivelmente sob ponto de vista clinico, inativando a enzima pelo resto de sua vida útil. Os reversíveis dividem-se em dois grupos, competitivos e nao-competitivos. Os competitivos se ligam a enzima no mesmo sitio ativo de seu substrato e pode ser revertido pelo aumento do próprio substrato. Os inibidores reversíveis competitivos não afetam a Vmax, somente o Km. Já os nao-competitivos não se ligam ao mesmo sitio do substrato, ou seja, eles diminuem a Vmax, mas não alteram o Km.

5. O que acontece se você mudar o pH ou a temperatura do meio reacional e mantiver a concentração da enzima e do substrato constantes. Explique

Cada enzima tem sua temperatura e pH ótimos. Se mudarmos estas constantes no meio reacional, mantendo a concentração da enzima e do substrato constantes sua atividade decairá bruscamente. Se plotarmos num gráfico atividade da enzima, em y, versus pH ou temperatura, em x, podemos verificar que a curva apresenta-se sob forma de parábola com concavidade para baixo, sendo que o pH ou temperatura que corresponde a atividade da enzima mais altos são o pH ou a temperatura ideal.

6. Cite Dois exemplos de enzimas que atuam em sistemas biológicos e explique sua atuação.

Os dois exemplos de enzimas de sistemas biológicos dadas aqui fazem parte do sistema de enzimas antioxidantes, as quais fazem parte da proteção do organismo contra radicais livres, causadores de diversos danos.

A enzima SOD – Superóxido Dismutase, está presente em quase todos os animais, e também em algumas plantas. Ela transforma o ânion superóxido, cujo tempo de meia vida é muito curto, mas capaz de causar dano à proteínas, lipídeos e ao DNA, em peróxido de hidrogênio, que apesar de não ser um radical livre é uma molécula muito tóxica às células. O peróxido de hidrogênio é neutralizado pela enzima CAT – Catalase, que degrada o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. Estas duas enzimas, juntamente com GPx e GR (Glutationa peroxidase e Glutationa redutase) formam a barreira enzimática aos danos causados pelos radicais livres. Estas enzimas podem ser medidas no sangue, plasma e soro, mas estão bastante presentes no fígado e diversos órgãos, onde impedem que os radicais livres façam seus danos nestes tecidos. Os radicais livres estão associados à diversas doenças, e acredita-se que eles sejam responsáveis pelo envelhecimento precoce. As atividades destas 2 enzimas não mudam significativamente em temperaturas de 0 a 40 graus Celsius, e estima-se que para cada molécula de substrato, milhares de enzimas estão presentes, a fim de aumentar a chance de encontro substrato/enzima.

7. As enzimas podem ser desnaturadas quando em contato com solução de surfactantes. Como isso pode ser explicado?

A perda da estrutura tridimensional suficiente para causar perda de função é denominada desnaturação. As proteínas podem ser desnaturadas não apenas pelo calor ou por extremos de pH, mas também por certos solutos ou solventes orgânicos e surfactantes, estes atuam principalmente promovendo o rompimento de interações hidrofóbicas que estabilizam as proteínas.

8. Com ajuda da literatura, descreva sucintamente os 04 mecanismos principais através dos quais as enzimas podem acelerar uma reação : Catálise, Ácido-Base; Torção de Substrato; Catálise Covalente; Diminuição de Entropia.

São 4 os mecanismos principais através dos quais as enzimas aceleram uma reação:

          - Catálise Ácido-Base  que ocorre com a participação de aminoácidos com cadeias laterais ionizáveis, capazes de doar ou liberar prótons durante a catálise.

            - Torção de Substrato, que depende da torção do substrato induzida pela ligação do mesmo com o sítio de ligação da enzima, alcançando o estado de transição e estimulando sua conversão em produto.

            - Catálise Covalente que resulta do ataque nucleofílico ou eletrofílico de um radical do sítio catalítico sobre o substrato, ligando-o covalentemente à enzima e induzindo a sua transformação em produto. Envolve com freqüência a participação de coenzimas.

            - Efeito de Diminuição da Entropia. As enzimas ajudam no posicionamento e na definição da estequiometria correta da reação, facilitando os mecanismos anteriores.

9. Que tipo de resíduos químicos foram gerados neste experimento e como foram tratados ou armazenados. Explique.

Foram gerados resíduos de solução de catecol + H2O2 + H2O + enzima + quinona correspondente. O volume de resíduos geados foi em quantidade bastante pequena e os reagentes estavam bastantes diluídos. Desta maneira os resíduos foram descartados em um recipiente específico.

Conclusões

Conclui-se que através dos gráficos pode-se observar que a absorbância varia de acordo com o tempo, sendo que é diretamente proporcional até aproximadamente 60 segundos tendendo a se manter constante conforme o tempo da reação vai passando.

Conforme os resultados é possível observar que a cinética enzimática de uma reação depende da concentração, sendo diretamente proporcional a esta nos primeiros valores, e tendendo a manter-se constante conforme aumentamos a concentração.

Verificou-se pelo gráfico da segunda parte do experimento que o comprimento de onda de 458nm foi utilizado pois na varredura o pico de absorbância se dá entre 450 e 460nm.

Bibliografia

MOORE, Walter J. Físico-Química. Rio de Janeiro: Ao Livro Técnico e S.A. e Editora da Universidade de São Paulo, 1968.

MURRAY, R. K.; GRANNERD. K.; MAYES P. A.; RODWELL V. W. Harper: Bioquímica, 7ª ed. São Paulo: Editora Atheneu, 1994.

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