Promocao de crescimento em meios de cultura

Promocao de crescimento em meios de cultura

MÉTODO DE ANÁLISE

MA: MI 008/00

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PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO EM MEIOS DE CULTURA

EMISSÃO: Out/2008

VENCIMENTO:Out/2010

ELABORAÇÃO:

Autor do POP

REVISÃO:

Gerente do setor

APROVAÇÃO:

Ger. Gar. Qualidade

1. OBJETIVO

Verificar as propriedades promotoras de crescimento microbiano dos meios de cultura utilizados para testes microbiológicos.

  1. EQUIPAMENTOS E MATERIAIS

  • Banho-maria a 45ºC  1ºC;

  • Fluxo Laminar;

  • Placas de Petri estéreis 90x15mm ;

  • Pipetas de 5ml e 10ml estéreis;

  • Solução de álcool 70%;

  • Tecido não liberador de partículas tipo Perfex;

  • Luvas descartáveis estéreis;

  • Pipetador;

  • Estufas Para incubação a temperaturas de 30-35ºC e 20-25ºC;

  • Contador de colônias.

  1. MEIOS DE CULTURA E REAGENTES

De acordo com o microrganismo a ser testado.

4. PROCEDIMENTOS

4.1 – Teste de Contagem Microbiológica

4.1.1 – Inoculação dos microrganismos

- Utilizar as seguintes cepas padrão:

Microrganismo

ATCC

Preparo da Cepa

Contagem

Aeróbica Total

Contagem de Fungos e Leveduras

Staphylococcus aureus

6538

TSA ou TSB

30-35ºC / 8-24 hs

TSA e TSB:  100 UFC

30-35ºC /  3 dias

NA

Pseudomonas aeruginosa

9027

TSA ou TSB

30-35ºC / 18-24 hs

TSA e TSB:  100 UFC

30-35ºC /  3 dias

NA

Bacillus subtilis

6633

TSA ou TSB

30-35ºC / 18-24 hs

TSA e TSB:  100 UFC

30-35ºC /  3 dias

NA

Candida albicans

10231

SDA ou SDB

20-25ºC / 2-3 dias

TSA e TSB:  100 UFC

30-35ºC /  5 dias

SDA:  100 UFC

20-25ºC /  5 dias

Aspergillus niger

16404

SDA ou SDB

20-25ºC / 5-7 dias ou até que ocorra boa esporulação

TSA e TSB:  100 UFC

30-35ºC /  3 dias

SDA:  100 UFC

20-25ºC /  5 dias

SDA: Agar Sabouraud

SDB: Caldo Sabouraud

TSA: Agar Soja Tripticaseína

TSB: Caldo Soja Tripticaseína

- Utilizar Tampão Fosfato pH 7,2 ou Tampão Peptona pH 7,0 para preparar diluições seriadas do microrganismo a ser utilizado. Para A.niger adicionar 0,05% de Polisorbato 80;

- Inocular as placas de TSA e SDA com uma pequena quantidade (não mais que 100 UFC) dos microrganismos indicados na tabela acima. Utilizar uma placa para cada microrganismo;

- Incubar por tempo e temperatura indicados na tabela.

4.1.2 - Resultados

- O crescimento obtido deve ser  70% do inóculo inicial.

4.2 – Pesquisa de Patogênicos

4.2.1 – Inoculação de microrganismos aeróbicos

- Utilizar as seguintes cepas padrão:

Microrganismo

Staphylococcus aureus

ATCC 6538

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 9027

Escherichia coli

ATCC 8739

Samonella abony

NCTC 6017

Bacillus subtilis

ATCC 6633

Candida albicans

ATCC 10231

Clostridium sporogenes

ATCC 11437

- Semear as bactérias separadamente em TSB ou TSA e incubar a 30-35ºC / 18-24hs;

- Semear Candida albicans e A.niger separadamente em SDA ou SDB e incubar a 20-25ºC / 2-3 dias;

- Utilizar Tampão Fosfato pH 7,2 ou Tampão Peptona pH 7,0 para preparar diluições seriadas do microrganismo a ser utilizado. Para A.niger adicionar 0,05% de Polisorbato 80.

4.2.2 – Promoção de crescimento

4.2.1. Meios líquidos

- Inocular o meio de cultura com 1ml de uma suspensão que contenha não mais que 100 UFC/ml do microrganismo a ser testado;

- Incubar bactérias a 30-35ºC / 18 a 24 horas e fungos e leveduras a 20-25ºC / 5 dias;

- Verificar o crescimento obtido e comparar com o crescimento em um meio previamente testado e aprovado.

- Repicar em meios seletivos para confirmação do microrganismo.

4.2.2. Meios sólidos

- Adicionar à superfície do meio de cultura 1ml de uma suspensão que contenha não mais que 100 UFC/ml do microrganismo e espalhar com a ponta da pipeta em várias direções (spread plate);

- Incubar bactérias a 30-35ºC / 18 a 24 horas e fungos e leveduras a 20-25ºC / 5 dias;

- Verificar o crescimento obtido e comparar as características das colônias com o descrito pelo fabricante e com meios previamente testados e aprovados.

Observações:

- Utilizar cepas padrão que tenham não mais que 5 passagens à partir da cepa original;

- Usar as suspensões preparadas em no máximo 2 horas ou, se mantidas em geladeira, por no máximo 24 horas.

- Como alternativa, ao invés de preparar uma suspensão de células viáveis de B.subtillis, A.niger e Clostridium sporogenes, uma suspensão estável de esporos pode ser utilizada.

- Realizar o controle negativo dos meios de cultura.

Estes testes devem ser realizados a cada lote do fabricante do meio de cultura.

4.3 - Registro dos Resultados:

- Registrar os resultados dos Testes de Promoção de Crescimento no Anexo 2.

5. DOCUMENTAÇÃO

5.1. – ANEXOS

Anexo 1 – Tabela de meios e microrganismos utilizados

Anexo 2 – Formulário de registro das análises dos meios

6. REFERÊNCIAS

USP 29

7. HISTÓRICO DE ALTERAÇÕES

Documento novo.

Anexo 1 - Tabela de Meios e Microrganismos Utilizados

Meio de Cultura

Sigla

Microrganismo

Agar Bismuto-Sulfito

BSA

Salmonella abony

Agar Cetrimide

CET

P. aeruginosa

Agar DNAse

DNAse

S. aureus

Agar Endo

ENDO

E. coli

Agar Mac Conkey

MAC

E. coli

Salmonella abony

P. aeruginosa

Agar Nutriente

NUT

S. aureus

B. subtilis

P. aeruginosa

E. coli

Salmonella abony

Agar Sabouraud

SAB
A . niger

C. albicans

Agar Soja Tripticaseína

TSA
S. aureus

B. subtilis

P. aeruginosa

E. coli
A . niger
C. albicans

Agar Manitol Salgado

MAN

S. aureus

Agar Verde Brilhante

VBA

Salmonella abony

Agar Xilose-Lisina-Descarboxilase

XLD

Salmonella abony

Caldo Soja Tripticaseína

com ou sem Tween

TSB

S. aureus

B. subtilis

P. aeruginosa

E. coli

A . niger

C. albicans

Caldo Selenito

SC

Salmonella abony

Caldo Tetrationato

TT

Salmonella abony

Anexo 2 - Formulário de Registro de Análises dos Meios

Meio de Cultura: __________________________________________________________________

Fabricante: __________________________________

Lote: _____________

Val.: _________

Microrganismo

Nº de Germes Utilizados

Resultado

Controle Positivo

Controle Negativo

Obs

OBS:

( ) APROVADO ( ) REPROVADO ( ) RETESTAR

Analista: ________________________________ Data: _____/_____/_____

Encarregado: ________________­­­­­____________ Data: _____/_____/_____

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