Relatório Bioquímica Experimental I proteínas

Relatório Bioquímica Experimental I proteínas

Relatório Bioquímica Experimental I – Aula do dia 19 de Abril de 2010

Introdução:

Proteínas:

As proteínas são polímeros de aminoácidos unidos por covalência, através de ligações peptídicas, uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-NH 2 ) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da formação de uma amida. Além disso, os diferentes grupamentos "R" encontrados nos aminoácidos influenciam na estrutura, na funcionalidade e nas propriedades das proteínas individuais.

A maioria das proteínas encontradas nos seres vivos são formadas por L-aminoácidos. Os D-aminoácidos aparecem somente em certos antibióticos peptídicos e em peptídeos componentes da parede de algumas bactérias. Apesar de muitas proteínas conterem outras substâncias, além dos aminoácidos, a estrutura tridimensional e muitas das propriedades biológicas das proteínas são determinadas, em grande parte, pelos tipos de aminoácidos presentes em sua molécula, a ordem em que eles estão unidos entre si, na formação da cadeia polipeptídica e, ainda, pela inter-relação espacial de um aminoácido com o outro.

Os vinte aminoácidos chamados de “aminoácidos padrões” existentes, quase nunca ocorrem em quantidades iguais em proteínas. Alguns aminoácidos podem ocorrer apenas uma única vez por molécula ou não comparecerem de todo em dado tipo de proteína, outros podem ocorrer em grande número. Podem ser estruturalmente classificadas em fibrosas ou globulares.

As proteínas ainda exercem na célula uma grande variedade de funções, que podem ser divididas em dois grupos:

(1) Dinâmicas: Transporte, defesa (anticorpo), catálise de reações, controle do metabolismo e contração, por exemplo;

(2) Estruturais: Proteínas como o colágeno e elastina, por exemplo, que promovem a sustentação estrutural da célula e dos tecidos.

As proteínas que apresentam uma ou mais cadeias polipeptídicas formando estruturas compactas, mais ou menos esféricas e que geralmente são solúveis denominam-se proteínas globulares. As proteínas fibrosas possuem forma alongada, geralmente insolúveis em meio aquoso e desempenham um papel basicamente estrutural nos sistemas biológicos. Ao contrário das globulares são formadas pela repetição de módulos, o que possibilita a construção de grandes estruturas, com organização que origina fibras. Ao descrever a estrutura de uma proteína, particularmente uma proteína globular é conveniente considerar a sua complexidade através de suas estruturas:

  • Estrutura primária - É a seqüência de aminoácidos ao longo da cadeia polipeptídica, específica para cada proteína.

  • Estrutura secundária - Descreve a formação de estruturas regulares pela cadeia polipeptídica. Pode ser α-hélice, folha pregueada.

  • Estrutura terciária - Descreve o dobramento final da cadeia polipeptídica por interação de regiões com estrutura regular.

  • Estrutura quaternária - Descreve a associação de duas ou mais cadeias polipeptídicas de estrutura terciária.

Procedimentos:

Na referida aula, foram realizados testes de precipitação de proteínas com os seguintes reagentes: reação de Heller; reação com metais pesados; reação TCA – ácido tricloroacético; com aquecimento; reação de Biureto.

Materiais utilizados:

Tubos de ensaio, grade de suporte, pipetas automática e graduada, bico de Bunsen.

Metodologia:

Seguindo as normas de segurança no laboratório, demos inicio a aula pratica de reações de precipitação de proteínas.

Etapa 1:

Foram identificados os tubos com os respectivos reagentes.

Etapa 2:

Foi dado início as reações de precipitação de proteínas.

2.1. Reação de Heller: foi pipetado 1 mL de HNO3 em um tubo de ensaio e adicionado lentamente 1 mL de solução de proteína – clara de ovo 10%. Foi observada a formação da zona de interface.

2.2. Reação com Metais pesados: foi pipetado 2 mL da solução de proteína –clara de ovo 10% - em um tubo de ensaio e adicionado lentamente com o auxilio de um conta gotas (CH3COO)2Pb até perceber a alteração na solução.

2.3. Reação TCA (ácido tricloroacético): em um tubo de ensaio foi pipetado 2mL de solução de proteína – clara de ovo 10% - em seguida foi adicionado com o auxilio do conta gotas ácido tricloroacético à 10% até perceber a mudança na solução (com 2 gotas já pode-se observar a mudança na solução).

2.4. Aquecimento: em um tubo de ensaio foi pipetado 2 mL de solução de proteína- clara de ovo 10%. Com o auxilio de uma pinça de madeira foi levado ao aquecimento a solução (bico de Bunsen), até observar a mudança na solução.

2.5. Reação de Biureto: em um tubo de ensaio foi pipetado 1 mL de solução de proteína- clara de ovo 10% - e 1 mL de reativo de Biureto.

Fundamentação teórica:

Precipitação de Proteínas com Desnaturação

As proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que está relacionada com suas propriedades físicas e biológicas. A modificação na estrutura tridimensional nativa de uma proteína, com a conseqüente alteração de suas propriedades é conhecida como desnaturação. A desnaturação envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária de proteínas, mas não da primária.

A desnaturação, usualmente decresce a solubilidade das proteínas. A diminuição da solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais hidrofóbicos e outros que prejudiquem a interação proteína-água e favoreçam a interação proteína-proteína. A desnaturação é o evento primário e importante. A floculação e a coagulação, que muitas vezes são confundidos com desnaturação de proteínas, são simplesmente manifestações visíveis das alterações estruturais causadas pelos agentes desnaturantes.

Existem vários agentes desnaturantes de proteínas, tais como: calor, ácidos, álcalis, solventes orgânicos, soluções concentradas de uréia e guanidina, detergentes, sais de metais pesados, etc. Entre as alterações que se observam em decorrência da desnaturação protéica, pode-se citar: diminuição da solubilidade, perda de atividade biológica (por exemplo, da ação enzimática, da ação hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptídica, alterações na viscosidade e coeficiente de sedimentação, etc.

A precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas para caracterizar a presença de proteínas em solução, também são úteis para proceder a desprotenização de líquidos biológicos para análise de componentes não protéicos.

Reação de Heller:

Quando adicionamos um ácido ao meio onde a proteína está dissolvida, a liberação de prótons para o meio provoca uma queda do pH. Os aminoácidos ácidos (aspartato e glutamato) captam os prótons dissociados que se ligam à carboxila que estava dissociada. Isto implica em uma redução das cargas negativas existentes nesta proteína, que passa a ter uma carga positiva em decorrência dos nitrogênios, existentes nos aminoácidos básicos (lisina, arginina e histidina), estarem carregados positivamente. Uma das forças que mantém estável a estrutura globular de uma proteína é a ligação iônica entre a carboxila (negativa) de um aminoácido ácido e o nitrogênio carregado com um próton de um aminoácido básico (positivo).

Se as carboxilas captarem prótons, anulando, desta forma, suas cargas, conclui-se que as ligações iônicas entre elas e os radicais básicos foram desfeitas.

Mais uma vez proteína se precipita que pela exposição dos radicais apolares hidrofóbicos que estavam no interior, quer seja pela formação de sais insolúveis entre os radicais básicos e os ânions dissociados provenientes do ácido que foi acrescido ao meio.

Reação com Metais pesados:

A adição de sais de metais pesados, tais como mercúrio, chumbo, cobre e zinco, levam à formação de sais denominados "quelatos" entre os aminoácidos ácidos e estes metais. A proteína precipita porque estes sais são insolúveis em água e também porque, com a quebra das ligações iônicas, os aminoácidos hidrofóbicos ficam mais expostos ao meio aquoso

Reação TCA (ácido tricloroacético):

Determinados agentes, como os reagentes para alcalóides podem ser usados na precipitação de proteínas, o que e útil na desproteinização de materiais biológicos, como o sangue: anions de ácidos complexos (tricloroacético, tânico, fosfotungstico) formam sais insolúveis onde a proteína funciona como cátion.

Aquecimento:

A estrutura terciária de uma proteína é mantida por interações hidrofóbicas entre os radicais apolares que se abrigam no meio aquoso, procurando se agruparem no interior do glóbulo protéico, pelas atrações iônicas entre os radicais carregados com cargas opostas, pelas pontes dissulfeto, pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas ou ainda pelas Forças de Van der Waals.

Ao fornecer energia a um meio aquoso contendo proteínas, atrações entre os radicais são desfeitas e a proteína é "desenrolada", expondo, ao meio aquoso seus radicais apolares que estavam contidos no seu interior. Isto é que leva à desnaturação.

Reação de Biureto:

Reativo de Biureto: Devido às ligações peptídicas e à presença de diferentes aminoácidos, as proteínas reagem com uma variedade de reagentes, formando produtos coloridos. A reação do Biureto é devida às ligações peptídicas, dando positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação é também positiva para as substâncias que contém 2 grupos carbamínicos (-CO-NH2) ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio.

Este é o caso do Biureto que dá reação positiva e de onde provém o nome da mesma. As proteínas ou peptídeos, quando tratados por uma solução de sulfato de cobre, em meio alcalino, dão uma coloração violeta característica

Discussão dos resultados:

TIPOS DE AGENTE

RESULTADOS

Reação de Heller

Separação da proteína e do ácido por um anel amarelado – zona de interface.

Metais pesados

Solução esbranquiçada, ppt branco.

TCA

Ppt branco com apenas 2 gotas de TCA.

Calor

Solução leitosa,ppt branco, superfície gelatinosa.

Biureto

Solução violeta, sem formação de ppt.

Reação de Heller:

Verificou-se que a solução protéica desnaturou, houve a formação de um anel branco que dividia a proteína da meta-proteína.

Reação com Metais pesados:

Observou-se pequenos precipitados semelhantes a fios brancos na solução.

O acetato de chumbo, na solução protéica, dissocia-se, liberando seus cátions e torna o meio alcalino. Essa característica do meio – pH situado no lado alcalino do ponto isoelétrico das proteínas - e favorável a combinação de algumas proteínas com os cátions do sal, formando proteinatos insolúveis

Reação TCA (ácido tricloroacético):

Foi possível identificar a formação de um precipitado esbranquiçado e viscoso grudado na

parede do tubo logo que se adicionou o acido tricloroacético (TCA).

Nesse experimento, o sal serve como ‘ponte’/interage entre a proteína e o meio, auxiliando assim, as interações proteína-água. O fato de se adicionar ácido tricloroacético solução de proteínas, reduz o ph do meio, tornando positiva a carga da proteína, o que contribui para a formação de um complexo insolúvel – o tricloroacetato de proteína. Além disso, vale ressaltar que o sal atua como uma ponte entre a proteína e o meio. Adicionando-se o acido, diminui a concentração de sal e a interação proteína-água.

Aquecimento:

Colocou-se 2mL de solução de proteínas em um tubo de ensaio que foi aquecido diretamente

na chama. Nesse experimento, a formação do coagulo branco ocorre graças ao calor que, ao provocar a agitação térmica da molécula protéica, rompe as interações entre os átomos, afetando sua estrutura tridimensional e consequentemente, diminui a solubilidade da proteína.

Reação de Biureto:

Uma vez que a reação do Biureto e caracterizada por identificar a presença de proteínas e

peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos, no qual uma substancia adicionada, o sulfato de cobre, interage com as ligações peptídicas ,pode-se concluir que a primeira amostra adquire coloração violeta, devido a presença de proteínas.

Conclusões:

As reações de coloração e precipitação (com ou sem desnaturação) de proteínas permitem a

caracterização dessas pela analise de suas propriedades químicas e físicas, entre elas, a presença de ligações peptídicas, estrutura molecular, solubilidade, forca iônica e concentração molar. A detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações especificas com determinados reativos, os quais originam substancias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação.

As reações de coloração não alteram a estrutura tridimensional da proteína, ao contrario das reações de precipitação que podem alterar as estruturas quaternárias, terciarias e secundarias das proteínas como as reações por ação térmica, presença de alcalóides, sais de metais pesados e solventes orgânicos.

Bibliografia:

http://www.scribd.com/doc/29031871/PROTEINAS-Reacoes-de-coloracao-e-precipitacao

http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/proteinas.htm

http://www.editora.ufla.br/revista/27_2/art23.PDF

http://www.scribd.com/doc/29031871/PROTEINAS-Reacoes-de-coloracao-e-precipitacao

http://www.bioq.unb.br/htm/praticas/rot8.htm

LEHNINGER, A. Lester. Fundamentos de Bioquímica. 4ª ed. São Paulo: Sarvier, 2006.

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